Identificación Bacteriana: Pruebas Bioquímicas, Moleculares y Determinación de Sensibilidad Antimicrobiana

Principios Fundamentales en Pruebas Bioquímicas Bacterianas

Las pruebas bioquímicas son esenciales para determinar las características metabólicas de las bacterias. Para asegurar la fiabilidad de estas pruebas, un cultivo bacteriano debe cumplir con los siguientes requisitos fundamentales:

• Cultivo puro y fresco: Es crucial utilizar un cultivo que no esté contaminado y que se encuentre en una fase de crecimiento activo. Esto aplica tanto a pruebas manuales como al uso de galerías comerciales.
• Medios de cultivo adecuados: Se deben emplear los medios de cultivo específicos e indicados para cada prueba bioquímica a realizar.
• Condiciones de asepsia: Todas las manipulaciones deben llevarse a cabo en estrictas condiciones de asepsia para prevenir contaminaciones externas que puedan alterar o falsear los resultados.
• Métodos estandarizados y reproducibles: Es imperativo aplicar metodologías reconocidas y validadas que garanticen la reproducibilidad y, por ende, la validez de los resultados obtenidos.

Pruebas Bioquímicas para la Identificación Bacteriana

Pruebas Enzimáticas Clave

Prueba de la Catalasa

Las bacterias aerobias y anaerobias facultativas frecuentemente sintetizan la enzima catalasa. Esta enzima tiene la función de hidrolizar el peróxido de hidrógeno (H₂O₂) en agua (H₂O) y oxígeno gaseoso (O₂). La liberación de oxígeno en forma de gas se manifiesta como la formación de burbujas, lo cual es el indicador de la reacción.

Procedimiento:

1. Añadir una gota de peróxido de hidrógeno al 30% a una colonia bacteriana previamente extendida sobre un portaobjetos.
2. Esperar aproximadamente 5 segundos.
3. Observar la reacción.

Interpretación:

• Catalasa positiva: Presencia de burbujeo (liberación de oxígeno).
• Catalasa negativa: Ausencia de burbujeo.

Prueba de la Oxidasa

Las bacterias aerobias y algunas anaerobias facultativas que poseen citocromos como parte de su cadena respiratoria sintetizan la enzima citocromo oxidasa (específicamente, citocromo c oxidasa). Para detectar su presencia, se utiliza un reactivo como la N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD) o la N,N-dimetil-p-fenilendiamina, que actúa como un donador de electrones artificial. En presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico, el reactivo se oxida formando un compuesto coloreado, el indofenol.

Procedimiento:

1. Frotar una porción de una colonia bacteriana sobre una tira de papel impregnada con el reactivo de oxidasa, o añadir el reactivo directamente a la colonia.
2. Esperar entre 10 y 30 segundos (algunas pruebas pueden requerir hasta 60 segundos).
3. Observar el cambio de color.

Interpretación:

• Oxidasa positiva: Desarrollo de un color azul oscuro, violeta o púrpura en la zona de reacción.
• Oxidasa negativa: La zona de reacción permanece incolora, o puede adquirir un ligero color rosado (que no debe confundirse con un positivo).

Pruebas de Metabolismo de Carbohidratos

a) Prueba de Oxidación-Fermentación (OF)

Esta prueba se utiliza para valorar si una bacteria tiene un metabolismo oxidativo (respiratorio) o fermentativo de los carbohidratos (generalmente glucosa).

b) Prueba de la ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido)

Permite determinar si la bacteria posee la enzima β-galactosidasa y, por lo tanto, es capaz de fermentar la lactosa rápidamente. Es especialmente útil para diferenciar fermentadores lentos de lactosa de los no fermentadores.

c) Prueba de Voges-Proskauer (VP)

Esta prueba sirve para determinar la capacidad de una bacteria de fermentar la glucosa por la vía butanodiólica, produciendo acetoína (acetilmetilcarbinol) como intermediario, el cual es detectado por la adición de reactivos específicos (α-naftol y KOH).

d) Prueba del Rojo de Metilo (RM)

Se utiliza para determinar la capacidad de una bacteria de fermentar la glucosa por la vía ácido-mixta. Esta vía metabólica provoca la formación de grandes cantidades de ácidos orgánicos estables, lo que resulta en un descenso significativo y mantenido del pH del medio.

Procedimiento (Prueba del Rojo de Metilo):

1. Suspender el inóculo bacteriano en el medio de cultivo específico (caldo MR-VP). Mezclar por rotación suave.
2. Incubar durante 24-48 horas (o hasta 5 días para algunos microorganismos) a 37 °C en condiciones de aerobiosis.
3. Tras la incubación, transferir 5 ml del cultivo a un tubo limpio.
4. Añadir 5 gotas de la solución indicadora de rojo de metilo.
5. Realizar la lectura inmediatamente.

Interpretación (Prueba del Rojo de Metilo):

• Rojo de Metilo positivo: El medio adquiere un color rojizo. Indica que la bacteria es positiva para la fermentación de glucosa por la vía ácido-mixta.
• Rojo de Metilo negativo: El medio permanece de color amarillento. Indica que la bacteria es negativa para la fermentación de glucosa por la vía ácido-mixta.

Indicadores de pH en Pruebas de Fermentación

En muchas pruebas de fermentación de azúcares, se incorpora un indicador de pH al medio de cultivo. Si la bacteria fermenta el carbohidrato presente, se producen ácidos como productos finales. Este aumento en la acidez provoca un descenso del pH del medio. El indicador de pH responde a este cambio virando de color; por ejemplo, un indicador puede virar de verde a amarillo si aumenta la acidez del medio (como se menciona en el texto original), señalando una reacción positiva de fermentación. Específicamente, si el medio se vuelve amarillo en una prueba de fermentación de azúcares, es porque la bacteria ha fermentado el carbohidrato que contenía el tubo, produciendo ácido.

Utilización de Fuentes Específicas de Nutrientes

Prueba del Citrato (Agar Citrato de Simmons)

Esta prueba se emplea para valorar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono y los compuestos amoniacales (sales de amonio) como única fuente de nitrógeno para su crecimiento.

Medio de cultivo: Se utiliza el agar citrato de Simmons, que es un medio definido que contiene citrato de sodio como única fuente de carbono y fosfato de amonio como fuente de nitrógeno. Incluye también el indicador de pH azul de bromotimol.

Procedimiento:

1. Realizar una siembra por estría en la superficie inclinada del agar citrato de Simmons.
2. Incubar durante 24 horas (puede requerir hasta 4-7 días para algunas bacterias) a 35 ± 2 °C en condiciones de aerobiosis.
3. Realizar la lectura.

Interpretación:

• Citrato positivo: Se observa crecimiento bacteriano y el medio vira a un color azul intenso.
• Citrato negativo: No hay crecimiento visible y no hay cambio de color, el medio permanece de color azul grisáceo (o su color original si es diferente).

Pruebas de Hidrólisis y Síntesis de Compuestos Específicos

Diversas pruebas bioquímicas se basan en la capacidad de las bacterias para hidrolizar sustratos específicos mediante enzimas o para sintetizar determinados compuestos.

Hidrólisis del Hipurato

Esta prueba valora si la bacteria sintetiza la enzima hipuricasa (o hipurato hidrolasa), capaz de hidrolizar el hipurato sódico en ácido benzoico y glicina.

Hidrólisis de la Esculina

Se utiliza para la identificación presuntiva de ciertos grupos bacterianos, como los estreptococos del grupo D (Enterococcus spp. y Streptococcus bovis group) y Listeria spp. Estas bacterias pueden hidrolizar la esculina a esculetina y glucosa en presencia de bilis. La esculetina reacciona con iones férricos produciendo un complejo de color marrón oscuro o negro.

Prueba de CAMP

La prueba de CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen) se utiliza para determinar la capacidad de una bacteria de sintetizar una proteína extracelular termoestable conocida como factor CAMP. Este factor produce una hemólisis sinérgica cuando actúa junto a la β-hemolisina de Staphylococcus aureus. Es característica de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B).

Otras Pruebas Metabólicas Relevantes

Prueba de la Ureasa

Esta prueba detecta la producción de la enzima ureasa por parte de la bacteria. La ureasa hidroliza la urea presente en el medio, liberando amoníaco (NH₃) y dióxido de carbono (CO₂). La liberación de amoníaco alcaliniza el medio, lo que provoca un cambio de color en el indicador de pH incorporado.

Procedimiento:

1. Inocular una o dos colonias bacterianas en un medio que contenga urea y un indicador de pH. Los medios más comúnmente utilizados son el caldo urea de Stuart y el agar urea de Christensen (generalmente preparado en tubo inclinado).
2. Incubar durante un periodo que puede variar de 4 a 48 horas (algunas bacterias pueden requerir más tiempo) a 35 ± 2 °C en condiciones de aerobiosis.
3. Realizar la lectura observando el cambio de color del medio.

Interpretación:

• Ureasa positiva: El medio cambia a un color fucsia. Esto se debe a que la degradación de la urea por la enzima ureasa libera amoníaco, lo que aumenta el pH del medio, haciendo que el indicador vire a rosa intenso.
• Ureasa negativa: No hay cambio de color, o el medio queda amarillento (su color original).

Prueba de las Descarboxilasas (Lisina, Ornitina, Arginina)

La detección de la actividad descarboxilasa se basa en los cambios de pH que ocurren en el medio. Inicialmente, la bacteria debe fermentar la glucosa presente, acidificando el medio. Esta condición ácida y anaerobia induce la producción de la descarboxilasa específica si la bacteria la posee. La descarboxilación del aminoácido produce una amina alcalina, revirtiendo el pH del medio hacia la alcalinidad.

Se utilizan indicadores de pH como el púrpura de bromocresol (que vira de amarillo en pH ácido a púrpura en pH alcalino) y, a veces, el rojo de cresol.

Prueba de la Coagulasa

Esta prueba permite determinar la capacidad de una bacteria para producir la enzima coagulasa. La coagulasa actúa sobre el fibrinógeno presente en el plasma sanguíneo, convirtiéndolo en fibrina, lo que resulta en la formación de un coágulo visible. Es una prueba clave para la identificación de Staphylococcus aureus.

Interpretación:

• Coagulasa positiva: Se observa la formación de un coágulo visible en el tubo con plasma inoculado.
• Coagulasa negativa: El plasma permanece líquido.

Observación de Patrones de Hemólisis en Agar Sangre

La capacidad de las bacterias para lisar los eritrocitos (hemólisis) se observa cultivándolas en medios con agar sangre. Se distinguen principalmente tres tipos de hemólisis:

• Hemólisis Alfa (α): Las colonias aparecen rodeadas por un halo de color verdoso o parduzco. Esto se debe a una lisis parcial de los eritrocitos con la consiguiente reducción de la hemoglobina a metahemoglobina.
• Hemólisis Beta (β): Las colonias quedan rodeadas por un halo completamente claro y transparente. Esto indica una lisis total de los eritrocitos.
• Hemólisis Gamma (γ) o No Hemólisis: No se observan cambios visibles en el agar sangre alrededor de las colonias.

Sistemas Comerciales para Pruebas Bioquímicas (Galerías)

Las galerías de pruebas bioquímicas comerciales son sistemas estandarizados y miniaturizados que permiten realizar múltiples pruebas bioquímicas simultáneamente. Generalmente, consisten en una placa o tira con múltiples pocillos o celdillas. Cada celdilla está identificada y contiene un sustrato deshidratado específico para una determinada prueba bioquímica. Al inocular la suspensión bacteriana, se rehidratan los sustratos y, tras incubación, se observan los cambios.

Identificación y Caracterización Adicional de Microorganismos

Serotipificación (Serotipado)

Un serotipo o serovar se refiere a una subdivisión de una especie bacteriana (o viral) que se distingue de otras cepas de la misma especie en función de sus antígenos de superficie celular. Estos antígenos pueden ser detectados mediante reacciones serológicas específicas. La serotipificación es crucial en epidemiología.

Métodos Genotípicos para la Identificación Bacteriana

Pregunta: Si se produce una infección por una bacteria que no había sido identificada anteriormente, ¿se podrá hacer un diagnóstico mediante métodos genotípicos?

Respuesta: Sí. Los métodos genotípicos se basan en el análisis directo del material genético de la bacteria (ADN o ARN). Técnicas como la secuenciación del gen ARNr 16S o la PCR permiten identificar una bacteria comparando su secuencia genética con bases de datos, incluso si es una especie nueva o raramente aislada, ya que se basan en identificar una bacteria por medio de su carga genética.

Identificación Rápida mediante Espectrometría de Masas: MALDI-TOF MS

Los equipos de MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – Time-Of-Flight Mass Spectrometry) son espectrómetros de masas que permiten identificar microorganismos en pocos minutos a partir de colonias. El principio se basa en generar un espectro de masas de las proteínas del microorganismo, que se compara con una base de datos. Los resultados son obtenidos mediante un software que muestra en una tabla un resumen con la información de todos los pocillos analizados.

Sensibilidad a Agentes Antimicrobianos y Resistencia Bacteriana

Pruebas de Sensibilidad Específicas para Cocos Grampositivos

En muestras de hemocultivo donde se observan cocos grampositivos, se suelen aplicar pruebas de sensibilidad para su identificación presuntiva, tales como:

• Prueba de sensibilidad a la optoquina: Utilizada para diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otros estreptococos α-hemolíticos.
• Prueba de sensibilidad a la bacitracina: Utilizada para diferenciar Streptococcus pyogenes (sensible) de otros estreptococos β-hemolíticos.

Mecanismos de Acción de Antibióticos y Particularidades de Resistencia

Ineficacia de Antibióticos frente a Micoplasmas

Pregunta: ¿Alguno de los mecanismos de acción de los antibióticos es ineficaz frente a los micoplasmas? ¿Por qué?

Respuesta: Sí. Los mecanismos de acción que inhiben la síntesis de la pared bacteriana son ineficaces contra los Mycoplasma spp., porque los micoplasmas carecen de pared celular.

Betalactamasas y su Impacto en Antibióticos Betalactámicos

Muchas especies bacterianas son capaces de sintetizar enzimas denominadas betalactamasas.

Pregunta: ¿Sobre qué antibióticos actúa esta enzima? ¿Qué mecanismo de acción tienen estos antibióticos?

Respuesta:

• Antibióticos afectados: Las betalactamasas actúan sobre antibióticos como la penicilina, las cefalosporinas y los carbapenémicos.
• Mecanismo de acción de estos antibióticos: Inhiben la síntesis de la pared celular bacteriana.
• Mecanismo de resistencia por betalactamasas: Consiste en la inactivación enzimática del antibiótico por hidrólisis del anillo betalactámico.

Resistencia en Bacterias Gramnegativas: Un Desafío Crítico

La OMS incluye tres bacterias gramnegativas dentro del grupo de prioridad crítica en cuanto a su resistencia a antibióticos.

Pregunta: ¿Las bacterias gramnegativas tienen alguna característica estructural que, de forma general, las haga menos sensibles a la actuación de ciertos antibióticos?

Respuesta: Sí. Las bacterias gramnegativas tienen una membrana externa en su pared que dificulta que los antibióticos puedan atravesarla, confiriéndoles una menor sensibilidad general a ciertos agentes.

Impacto de la Automedicación: Una Perspectiva Individual y Colectiva

Afirmación: Si una persona se automedica con un antiinflamatorio o con un somnífero, puede sufrir, de forma individual, efectos negativos. Si se automedica con un antibiótico, está agravando un problema colectivo.

Explicación:

Cuando una persona se automedica con antiinflamatorios o somníferos, puede experimentar efectos negativos individuales como reacciones alérgicas, alteración en la flora intestinal (aunque menos directo que con antibióticos), etc. Sin embargo, cuando se automedica con un antibiótico, agrava un problema colectivo, ya que esto favorece la selección y diseminación de resistencia bacteriana, lo que provoca que los tratamientos para infecciones futuras sean más difíciles y costosos para toda la comunidad.

Métodos para Determinar la Sensibilidad a los Antibióticos

Método de Difusión en Disco (Prueba de Kirby-Bauer)

El método de difusión en disco consiste en colocar uno o varios discos de papel de filtro impregnados con concentraciones conocidas de antibiótico sobre una placa de agar previamente inoculada de manera uniforme con el microorganismo objeto de estudio. Tras la incubación, los resultados obtenidos se expresan mediante la medición del diámetro del halo de inhibición formado alrededor de cada disco. Este diámetro se interpreta como sensible, intermedio o resistente según estándares establecidos.

Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)

La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) es la concentración mínima de antibiótico que, en condiciones normalizadas, es capaz de impedir el crecimiento visible de una determinada cepa bacteriana.

Métodos para determinar la CMI:

Los principales métodos para obtener este parámetro son:

• Métodos de dilución (en caldo o en agar).
• Métodos de difusión con gradiente (ej. E-test).

Aplicaciones de las Pruebas Serológicas en la Identificación de Microorganismos

Las pruebas serológicas son técnicas de diagnóstico que se basan en la detección de la interacción específica antígeno-anticuerpo para la identificación de microorganismos.

Técnicas de Aglutinación

Se basan en la capacidad de los antígenos particulados multivalentes para unirse a sus anticuerpos complementarios, dando lugar a inmunocomplejos o agregados visibles a simple vista.

Análisis de Inmunoadsorción Ligados a Enzimas (ELISA)

Estos ensayos utilizan antígenos o anticuerpos marcados con una enzima e insolubilizados sobre un soporte. De esta forma, la reacción antígeno-anticuerpo queda inmovilizada en el soporte y puede ser fácilmente revelada mediante la adición de un sustrato específico que, tras la actuación de la enzima, produce un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o de un colorímetro.

Cuestiones de Repaso: Verdadero o Falso con Justificación

A continuación, se evalúan diversas afirmaciones relacionadas con la microbiología diagnóstica:

• a) Una bacteria anaerobia facultativa puede dar positivo a catalasa.
  Verdadero. Muchas anaerobias facultativas poseen catalasa.
• b) Las bacterias anaerobias estrictas sintetizan citocromo oxidasa.
  Falso. Las anaerobias estrictas no suelen sintetizar citocromo oxidasa. Algunas bacterias anaerobias facultativas sí pueden ser oxidasa positivas.
• c) La prueba OF (Oxidación-Fermentación) permite saber si la bacteria es aerobia o anaerobia.
  Parcialmente Verdadero/Necesita Matización. La prueba OF diferencia el metabolismo oxidativo del fermentativo. Si bien los aerobios estrictos son oxidativos y los anaerobios estrictos suelen ser fermentadores, los anaerobios facultativos pueden presentar ambos tipos de metabolismo. Por lo tanto, la prueba ayuda a caracterizar el metabolismo del carbohidrato, lo que indirectamente da pistas sobre sus requerimientos de oxígeno, pero no define estrictamente la condición de aerobiosis o anaerobiosis por sí sola.
• d) La prueba ONPG permite saber si la bacteria es capaz de fermentar glucosa.
  Falso. La prueba de la ONPG permite saber si la bacteria es capaz de fermentar la lactosa, al detectar la enzima β-galactosidasa.
• e) Para probar si la bacteria es capaz de fermentar varios carbohidratos se puede usar la prueba de la ONPG.
  Falso. La prueba de la ONPG es específica para la fermentación de lactosa. Para múltiples carbohidratos se usan series de fermentación individuales.
• f) La prueba del agar hierro de Kligler (KIA) es una prueba combinada que se usa para la diferenciación de enterobacterias.
  Verdadero. El KIA (o TSI) evalúa la fermentación de glucosa y lactosa, producción de gas y H₂S, siendo clave para enterobacterias.
• g) Para identificar el tipo de respiración anaerobia que tienen las bacterias se puede usar la prueba de reducción de nitratos.
  Verdadero. La reducción de nitratos es una forma de respiración anaerobia donde el nitrato actúa como aceptor de electrones.