Técnicas Fundamentales en el Estudio del ADN
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y la Secuenciación de Sanger
La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es una técnica fundamental para estudiar el ADN, cuya finalidad es obtener múltiples copias de un fragmento específico, normalmente de entre 100 y 1000 pares de bases. El proceso consta de tres etapas:
- Desnaturalización: separación de las hebras de ADN.
- Hibridación (annealing): unión de los cebadores o primers al ADN.
- Extensión: donde la Taq polimerasa sintetiza nuevas hebras utilizando dNTPs (dATP, dGTP, dCTP y dTTP).
Para ello se necesitan dos cebadores específicos, uno Forward y otro Reverse, diseñados a partir de la secuencia conocida del ADN.
La secuenciación de Sanger, basada en la PCR, permite determinar la secuencia exacta del ADN mediante el uso de didesoxinucleótidos (ddNTPs), que carecen del grupo hidroxilo (OH) en el carbono 3’, impidiendo la continuación de la cadena y generando fragmentos de distintos tamaños. Estos nucleótidos están marcados con fluoróforos, lo que permite identificar cada base al pasar por un láser durante la electroforesis capilar, donde los fragmentos se separan según su tamaño. Esta técnica es muy precisa, aunque de bajo rendimiento, ya que solo permite leer fragmentos de hasta 1000 pares de bases y requiere conocer previamente las secuencias para diseñar los cebadores.
Secuenciación Masiva (Next-Generation Sequencing – NGS)
La secuenciación masiva (o NGS) es un conjunto de técnicas modernas que permiten obtener millones de secuencias de ADN simultáneamente, con el objetivo de analizar todo el genoma de una sola vez, aunque también puede enfocarse en regiones específicas. A diferencia del método de Sanger, estas técnicas presentan un alto rendimiento, ya que permiten procesar gran cantidad de datos de forma paralela. Sin embargo, su tasa de error es mayor, puesto que el análisis no se realiza base a base y es más difícil detectar errores individuales. Una de sus principales ventajas es que no requiere conocer previamente las secuencias de ADN ni diseñar cebadores específicos, lo que soluciona una de las limitaciones de las técnicas tradicionales.
Illumina: Secuenciación por Síntesis
Es la técnica de secuenciación más empleada. Realiza lecturas cortas (típicamente 2×150 pares de bases, en lecturas pareadas). Tiene un rendimiento muy alto, ya que en poco tiempo se consiguen muchísimas secuencias. Aunque se genera mucha información, las moléculas son muy cortas, por lo que al tener tantas, la tasa de error puede ser mayor.
PacBio: Single Molecule Real-Time (SMRT) Sequencing
Mediante esta técnica, se consiguen moléculas muy largas, pero la cantidad de información es intermedia. Además, al ser tan largas, la tasa de error es alta, por lo que puede combinarse con la técnica anterior para mejorar los resultados.
Nanopore: Secuenciación por Nanoporos
En esta técnica, la molécula de ADN se pasa a través de un poro que es una enzima. Esta enzima es sensible a la secuencia que va pasando, ya que cada base produce cambios conformacionales en la proteína que se traducen en una señal de voltaje en la membrana. Estos cambios son leídos por una máquina. Tiene una tasa de error elevada y un rendimiento medio, además de una excelente longitud de lectura de hasta 500 kb, siendo las más largas en este momento.
El Genoma Humano y su Variabilidad
Composición del Genoma Humano
El genoma humano es el conjunto completo de secuencias de ADN dentro de los 23 pares de cromosomas en los núcleos celulares (genoma nuclear, con aproximadamente 3 x 10⁹ pares de bases o 3 Gb) y una molécula de ADN que está dentro de las mitocondrias individuales (genoma mitocondrial, con aproximadamente 16,000 pb). El Proyecto Genoma Humano arrancó en 1990.
Los parches novedosos son regiones cromosómicas del genoma con suficiente variabilidad como para diferir de la secuencia de referencia original.
Polimorfismos Genéticos: La Base de la Diversidad
Los polimorfismos genéticos son variaciones en la secuencia del ADN que se presentan entre los individuos de una misma especie y constituyen la base de la diversidad genética humana. Estas diferencias pueden o no tener efectos visibles, pero en algunos casos influyen en rasgos físicos, respuesta a medicamentos o predisposición a ciertas enfermedades.
Polimorfismo de Nucleótido Único (SNP)
El tipo más común de polimorfismo es el SNP (Single Nucleotide Polymorphism), que consiste en el cambio de una sola base en una posición concreta del ADN. Aunque la mayoría no tiene consecuencias funcionales, algunos pueden alterar la expresión de genes o la función de proteínas, afectando así distintos procesos biológicos.
Microsatélites
Otro tipo de polimorfismo son los microsatélites, que son secuencias cortas repetidas en tándem dentro de regiones no codificantes del genoma. El número de repeticiones varía entre individuos, lo que los hace muy polimórficos y fáciles de identificar mediante técnicas como la PCR. Gracias a ello, se emplean ampliamente como marcadores genéticos en estudios de identificación, parentesco o asociación con características fenotípicas.
Variantes Estructurales y Variaciones en el Número de Copias (CNV)
También existen las variantes estructurales, que afectan a regiones del ADN mayores de 1000 pares de bases e incluyen deleciones, inserciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones. Dentro de ellas destacan las variaciones en el número de copias (CNV), en las que un fragmento del ADN puede estar presente en más o menos copias dependiendo del individuo. Estas variaciones se han relacionado con diferencias en funciones como la percepción sensorial, la inmunidad y la susceptibilidad a enfermedades.
En conjunto, los polimorfismos son esenciales para entender la variabilidad genética.
Regulación de la Expresión Génica
Mecanismos de Regulación Génica
La regulación génica es el conjunto de procesos celulares que aumentan o disminuyen los productos finales de los genes. Como consecuencia, pueden suceder diferenciaciones celulares o morfogénesis en el embrión, causando la aparición de diferentes linajes celulares con perfiles de expresión distintos a partir del mismo genoma. Además, esta regulación también está influida por estímulos del ambiente. Por ejemplo, hay genes como los de la hemoglobina que son genes de mantenimiento (housekeeping), ya que están siempre activos manteniendo las funciones vitales basales. Todas las etapas de la expresión génica pueden ser moduladas y reguladas, desde la apertura de la cromatina, la transcripción, la modificación postranscripcional, el transporte de ARN y la traducción, hasta la degradación del ARN. Por ejemplo, son esenciales el splicing, la adición del capuchón en el extremo 5’ y la poliadenilación en el extremo 3’.
Técnica de Microarray
Se sintetizan placas con pocillos en los que se encuentran sondas, que son segmentos de ADN de interés, a los cuales se van a hibridar los transcritos. Luego, mediante técnicas fluorométricas, se observa si se ilumina o no el pocillo, conociendo así si hay correspondencia y cuáles son los genes que se están transcribiendo.
Epigenética: Modificaciones Heredables sin Cambios en el ADN
Los cambios epigenéticos son parte del desarrollo normal. Las células de un embrión comienzan con un genoma maestro. A medida que las células se dividen, algunos genes se activan y otros se inhiben. Con el tiempo, por esta reprogramación epigenética, algunas células se convierten en células del corazón y otras en células del hígado. Cada uno de los cerca de 200 tipos de células que presenta el cuerpo tiene esencialmente el mismo genoma, pero un epigenoma propio y distinto.
Principales Mecanismos Epigenéticos
- Metilación del ADN: Tiene lugar en el carbono 5′ de las bases de citosina y está involucrada en la regulación de la transcripción. La hipermetilación en los promotores generalmente silencia la transcripción, mientras que la metilación en las regiones codificantes la aumenta. La metilación del ADN es un paso crucial que controla la velocidad a la que se produce la transcripción, lo que la hace detectable y posiblemente reversible para fines terapéuticos.
- MicroARN (miARN): Son pequeñas moléculas de ARN de unos 22 nucleótidos que suelen unirse a la región 3’ no traducida (3’-UTR) del ARNm, causando su degradación y el silenciamiento de la traducción.
- Modificaciones Postraduccionales de las Histonas (PTM): Controlan la accesibilidad del ADN a la maquinaria transcripcional. Al acetilarse las histonas en los residuos de lisina, se reduce la carga positiva (+) de las histonas y la fuerza de interacción con el esqueleto de fosfatos del ADN (-), favoreciendo la transcripción génica. En cambio, la hipoacetilación se asocia con el silenciamiento transcripcional. Actualmente se sabe que es un mecanismo más complejo.
Análisis y Ensamblaje del Genoma
Ensamblaje de novo vs. Resecuenciación
Es diferente ensamblar un genoma de novo que resecuenciar un genoma para el que ya existe una referencia.
- Resecuenciar: Mapear las lecturas cortas (reads) contra el genoma de referencia e identificar variantes.
- Ensamblar de novo: Construir una secuencia genómica a partir del solapamiento entre lecturas cortas (reads).
Haplotipos
Un haplotipo es una agrupación física de variantes genómicas (o polimorfismos) que tienden a heredarse juntas, porque no suele haber recombinaciones entre ellas al estar muy cerca en el cromosoma. Un haplotipo puede referirse a una combinación de alelos en un solo gen, alelos en múltiples genes o variantes en regiones intergénicas. Un haplotipo específico por lo general refleja una combinación única de variantes que están próximas en un cromosoma.
Genética Humana: Adaptación, Herencia y Enfermedades
Adaptaciones Genéticas: El Caso de los Inuit
Los inuit presentan adaptaciones tanto al frío como a una dieta rica en grasas y proteínas, especialmente en ácidos grasos poliinsaturados provenientes de animales marinos. Genéticamente, destacan por el gen FADS, que regula el equilibrio entre omega-3 de cadena corta, típicos de dietas vegetales, y omega-3 de cadena larga, abundantes en su alimentación tradicional, evitando así un exceso de estos últimos. Estas adaptaciones influyen en el metabolismo, reduciendo los niveles de colesterol LDL y de insulina en ayunas, y afectan la secreción de la hormona del crecimiento, lo que contribuye a su menor estatura en comparación con otras poblaciones. Además, la selección de variantes del gen FADS en respuesta a cambios dietéticos permite ajustar el perfil de ácidos grasos. Cabe señalar que un consumo elevado de omega-3 puede resultar perjudicial para individuos que no estén genéticamente adaptados a dietas altas en grasas y proteínas.
Excepciones a la Herencia Mendeliana
Enfermedades Autosómicas Dominantes
A continuación, un resumen de las excepciones a la herencia mendeliana en enfermedades autosómicas dominantes:
- Pleiotropía: Un solo gen provoca múltiples efectos distintos en el organismo. Ejemplo: en la esclerosis tuberosa pueden aparecer epilepsia, exantema facial y dificultades de aprendizaje, pudiendo manifestarse todos, algunos o ninguno.
- Expresividad variable: La gravedad y las características de la enfermedad difieren entre personas. Ejemplo: en la enfermedad poliquística autosómica dominante, algunos presentan insuficiencia renal temprana y otros solo quistes leves.
- Penetrancia reducida: Algunos individuos heterocigotos muestran pocos o ningún síntoma, dando la impresión de que la enfermedad “se salta” generaciones. Puede depender de factores ambientales o de la interacción con otros genes.
- Homocigosidad en rasgos dominantes: Aunque estas enfermedades suelen ser graves y raras, puede nacer un hijo homocigoto si ambos padres son heterocigotos. El efecto puede ser más grave o similar al de los heterocigotos según el tipo de variante:
- Ganancia de función: heterocigotos y homocigotos presentan síntomas similares (ej. enfermedad de Huntington).
- Pérdida de función: los homocigotos tienen síntomas más tempranos o graves (ej. hipercolesterolemia familiar).
Enfermedades Autosómicas Recesivas
- Pseudodominancia: Si un progenitor es homocigoto (y por tanto, enfermo) y el otro es heterocigoto, la descendencia tiene una probabilidad del 50% de manifestar la enfermedad autosómica recesiva.
- Consanguinidad y heterogeneidad de locus: La consanguinidad aumenta la probabilidad de herencia recesiva. La heterogeneidad de locus ocurre cuando mutaciones en diferentes genes pueden causar la misma enfermedad (p. ej., en la sordera neurosensorial).
Trastornos Ligados al Cromosoma X
Expresión variable en mujeres heterocigóticas
Las mujeres heterocigóticas pueden mostrar un fenotipo en mosaico, combinando células normales y con la variante. Esto ocurre si, durante el desarrollo, una mutación afecta a una célula y a todas sus descendientes. También sucede por la inactivación aleatoria del cromosoma X, donde unas células expresan un alelo y otras, el otro. Ejemplo: en el albinismo ocular ligado al X, los hombres carecen de pigmento, mientras que las mujeres heterocigóticas muestran un patrón en mosaico en el iris y el fondo ocular, debido a la inactivación del X y la formación del corpúsculo de Barr.
Mujeres afectadas por trastornos ligados al X
- Homocigosidad para alelos recesivos: poco frecuente por la rareza de estos trastornos.
- Inactivación sesgada del cromosoma X: si el cromosoma X activo mayoritario lleva la variante, la portadora puede mostrar síntomas (portadora manifestante).
- Anomalías numéricas del X: por ejemplo, mujeres con un solo cromosoma X (síndrome de Turner) pueden manifestar caracteres recesivos ligados al X.
Alelos Múltiples
Algunos genes tienen más de dos formas alélicas, que pueden determinar diferentes tipos de herencia entre sí. Algunos de estos alelos determinan una herencia dominante, mientras que otros son recesivos. Por ejemplo, en el caso de los grupos sanguíneos AB0, existen los alelos A, B y 0. Entre ellos, A y B son codominantes y ambos dominan sobre 0.
Herencia Poligénica y Distribución Normal
Varias características humanas, como la talla, la presión arterial o la inteligencia, poseen una distribución normal en la población, con un mayor porcentaje de individuos en la media del carácter. Esta distribución se debe a una herencia poligénica, que está relacionada con la acción aditiva de muchos genes diferentes. Sin embargo, también existen factores no aditivos. La talla está influida por el ambiente y posiblemente por genes que no son aditivos, sino que ejercen un efecto dominante. Los factores no aditivos son probablemente responsables de la tendencia conocida como regresión a la media (padres altos con hijos de talla superior a la media, pero inferior al valor parental medio; padres muy bajos con hijos de talla inferior a la media, pero superior al valor parental medio). Si un rasgo tuviese una herencia puramente poligénica sin influencias externas, las medias de la descendencia se distribuirían homogéneamente alrededor de la media de los valores de los progenitores.
Estudios Genéticos en Poblaciones
Estudios de Grupos Migrantes
Se estudia la incidencia de una enfermedad en grupos de migrantes que se desplazan de una población con baja incidencia a una con elevada incidencia. Si la incidencia en el grupo de migrantes se vuelve similar a la de su nuevo grupo de población, indicaría que los factores ambientales son más importantes. Si, por el contrario, mantienen una incidencia baja, indicaría que los factores genéticos son más determinantes.
Estudios de Asociación del Genoma Completo (GWAS)
Cociente de Posibilidades (Odds Ratio – OR)
El Odds Ratio (OR) es la relación entre el riesgo de sufrir una enfermedad con un determinado genotipo y el riesgo de sufrirla sin él. Indica la fuerza de asociación entre un locus y una enfermedad o rasgo. Si la asociación es clara, significa que el alelo codificado por el marcador está implicado directamente en la causa de la enfermedad (siendo una variante de predisposición) o bien está en desequilibrio de ligamiento con una variante de predisposición muy cercana. En un estudio típico de GWAS (Genome-Wide Association Study) se genotipan aproximadamente 1 millón de SNPs en cada sujeto, por lo que el tamaño de la muestra ha de ser muy elevado. Los GWAS no parten de una hipótesis previa, por lo que su estudio permite descubrir asociaciones que proporcionen nuevos puntos de vista sobre vías biológicas, abriendo nuevos caminos a la investigación. Antes se centraban en alelos frecuentes (> 5% en la población), pero solo explicaban una pequeña parte de la variación (menos del 10% para la mayoría de rasgos). Ahora se cree que la «heredabilidad perdida» es resultado de variantes más infrecuentes, que tienen un efecto mayor por alelo.
Puntuación de Riesgo Poligénico (PRS)
Las estimaciones de efectos de múltiples variantes genéticas, determinadas a partir de un GWAS, se pueden combinar en una única variable: una puntuación de riesgo poligénico (PRS) para un individuo, que representa su susceptibilidad genética global para una enfermedad. Existen varios métodos para determinar qué variantes genéticas deberían incorporarse en las PRS. En el futuro, la identificación de grupos de individuos con un riesgo elevado de enfermedad según su PRS puede facilitar el diseño e implementación de estrategias de intervención.
Importancia de Identificar Loci Implicados en Enfermedades Comunes
Conocer los loci implicados en enfermedades comunes es crucial por varias razones:
- Mejorar el diagnóstico: Conocer los genes y las variantes implicadas nos permite estratificar la enfermedad y, de esta manera, hacer un diagnóstico más preciso.
- Mejorar la eficacia de los medicamentos: Conocer los genes implicados en una enfermedad permite identificar dianas terapéuticas hacia las cuales dirigir la investigación para el desarrollo de fármacos.
- Reducir los efectos secundarios de los medicamentos: Un diagnóstico más preciso y unos tratamientos más eficaces permitirían reducir los efectos secundarios de los medicamentos.
- Mejorar la prevención: La medicina personalizada es muy cara, pues hay que amortizar la investigación dirigida a unos pocos pacientes. Por eso es fundamental mejorar la prevención. La aplicación de puntuaciones de riesgo poligénico puede mejorar la identificación de grupos de riesgo hacia los cuales dirigir programas de prevención específicos.