Técnicas de Histoquímica e Inmunohistoquímica: Fundamentos, Métodos y Aplicaciones Diagnósticas

Histoquímica Enzimática (Histoenzimología)

¿Qué son las técnicas de histoquímica enzimática?

• Técnicas para demostrar la presencia y actividad enzimática al reproducir la reacción que se daría in vivo (control de temperatura, pH, presencia de cofactores o precursores de coenzimas, etc.), detectando así las enzimas.
• La técnica se aplica in situ (en un corte histológico).
• Durante la fijación, es importante conservar la actividad enzimática. Es recomendable trabajar con material congelado sin fijación química, por ejemplo, evitando el formol.
• Se busca localizar dónde se produce la reacción al observarla al microscopio, añadiendo un producto que reacciona con el sustrato. Se utilizan cromógenos que cambian sus propiedades fisicoquímicas debido a la reacción, haciéndose visibles.
• Esta técnica está quedando en desuso debido al avance de la inmunohistoquímica y las técnicas de patología molecular.
• El resultado de la técnica se observará:
  • Opaco a la luz blanca, UV y haz de electrones.
  • Luminiscente en fluorescencia.

Fundamento

• Existen diferentes técnicas de sustrato, pero la más frecuente es la técnica histoquímica de acoplamiento:
  • Intervienen dos reacciones químicas simultáneas y acopladas:
    • 1ª. Reacción de transformación enzimática del sustrato.
    • 2ª. Producción y precipitación del cromógeno.
• Durante estas reacciones intervienen cuatro elementos muy importantes:
  • Sustrato.
  • Producto Primario de la Reacción (PPR): es el resultado de la reacción de la enzima con el sustrato, y actúa como acoplador entre las dos reacciones químicas.
  • Precursor incoloro.
  • Producto Final de la Reacción (PFR): compuesto coloreado que precipita.
• Intervienen dos reacciones químicas simultáneas y acopladas:
  • 1ª. Reacción de transformación enzimática del sustrato.
    • La reacción de la enzima con el sustrato genera el Producto Primario de la Reacción (PPR), que actúa como acoplador entre la primera y segunda reacción.
  • 2ª. Producción y precipitación del cromógeno.
    • Se utiliza un precursor incoloro, que suele ser una sal de diazonio.

Sal de diazonio + PPR = compuesto azoico (-N=N-) coloreado (PFR).

Detección de Enzimas Específicas

• Las siguientes secciones describen técnicas para detectar diferentes enzimas.

Fosfatasa Alcalina

• Enzima que aumenta en enfermedades óseas (neoplasias y fracturas) y hepáticas (por ejemplo, obstrucción biliar).
• Hidroliza enlaces éster.
• Con esta prueba se busca localizar la actividad enzimática.

NADPH-Diaforasa

• NADPH-diaforasa es el nombre genérico de cualquier enzima capaz de transferir electrones entre el NADPH o NADH a un aceptor, como la sal de tetrazolio, a través de enzimas como la óxido nítrico sintasa.
• Técnica que muestra moléculas deshidrogenasas como NADH, NADPH, etc.
• A través del NADPH, se reduce una sal de tetrazolio a una sal coloreada (formazán).
• Técnica usada habitualmente en tejido nervioso para detectar la enzima óxido nítrico sintasa.

ATPasas

• Utilizada en la determinación de miopatías.
• Según su concentración, permite determinar el tipo de fibra muscular (I o II).
• Se realiza con incubaciones a diferente pH.
  • Un medio ácido inhibe la ATPasa en la miosina de fibra rápida.
  • Un medio básico inhibe la ATPasa de fibras lentas.
• La técnica se basa en incubar el tejido con ATPasa e iones Ca²⁺, junto con sales de cobalto, a las que se le añade el sustrato (ATP).
• La sal de cobalto se transforma en fosfato de cobalto, visible al microscopio óptico (MO).
• El proceso se repite a diferentes pH.

Histoquímica de las Lectinas

¿Qué son las lectinas?

• Las lectinas son proteínas o glicoproteínas no inmunes que se unen a determinados azúcares.
• Unión específica a un carbohidrato concreto al que presentan afinidad.
• Pueden utilizarse conjuntamente con inmunohistoquímica para obtener coloración.
• También se utilizan en otras técnicas como ELISA, Western blot (electroforesis + inmunodetección) y cromatografía de afinidad.

Aplicaciones de las Lectinas

• Detección diferencial de oligosacáridos en procesos como el desarrollo, crecimiento, diferenciación, neoplasias, etc. Son una herramienta diagnóstica en anatomía patológica, ya que los tejidos patológicos pueden mostrar azúcares diferentes a los normales.
• Técnica útil en:
  • Identificación de tumores por su alta especificidad, por ejemplo, en tumores gastrointestinales.
  • Reconocimiento de grupos sanguíneos al unirse a antígenos específicos.
  • Unidas a fluorocromos para cuantificar y separar poblaciones celulares mediante citometría de flujo (ej. leucemia).
  • Como trazador neuronal, mostrando las rutas neuronales.
• Las ventajas de las lectinas son su bajo precio y alta estabilidad.
• Desventaja: reaccionan con azúcares terminales presentes en múltiples proteínas, pero no con una proteína en concreto. Por lo tanto, permiten observar la cantidad alterada, pero no la proteína específica. La inmunohistoquímica, en cambio, proporciona información mucho más valiosa al detectar proteínas específicas.

Detección de Lectinas

• La detección se realiza mayoritariamente con tejidos congelados.
• Las lectinas pueden conjugarse con moléculas fluorescentes, enzimas, anticuerpos, etc.
• La lectina se marca con moléculas fluorescentes o enzimas, como la fosfatasa alcalina.
  • Luego se detecta la presencia de la enzima o directamente la molécula fluorescente.
• La técnica requiere:
  • Controles positivos: Exponer la lectina a tejidos con una elevada concentración de oligosacáridos conocidos para confirmar la afinidad de la lectina.
    • Por ejemplo, eritrocitos y endotelio, ya que las lectinas tienen afinidad por estas células.
  • Controles negativos: Preincubar la lectina con un exceso del azúcar por el que tiene afinidad, para que no queden sitios libres y así demostrar la especificidad de la unión.
• Lectinas más utilizadas:
  • HPA: para tumores metastásicos y de mal pronóstico.
  • GSA-IB4: detecta el acúmulo de glicolípidos patológicos.
  • UEA-I: detecta el endotelio vascular para mostrar daño endotelial, por ejemplo, en dermatomiositis (inflamación de músculo y piel).

Inmunohistoquímica

Conceptos Fundamentales

Anticuerpos

• Las inmunoglobulinas (Ig) o anticuerpos (Ac) son glicoproteínas sintetizadas por linfocitos B.

Antisueros (Policlonales y Monoclonales)

• Formados por plasma con anticuerpos, se clasifican en:
  • Policlonales: Mezcla de inmunoglobulinas (Ig) que responden a diferentes epítopos de un mismo antígeno. Se obtienen al inyectar un antígeno (Ag) a un animal de una especie diferente, lo que resulta en Ig producidas por diferentes clones de linfocitos.
  • Monoclonales: Todos los anticuerpos reaccionan al mismo epítopo porque provienen del mismo linfocito B. Se obtienen al fusionar células de linfocitos B con mielomas, generando hibridomas.

Técnicas de Inmunohistoquímica (IHQ)

Métodos Directo e Indirecto

• Existen dos métodos:
  • Directo: El antisuero primario está marcado, y la reacción se realiza en un solo paso.
  • Indirecto: El antisuero primario no está marcado y es reconocido por un antisuero secundario (o terciario) marcado.
• Inconvenientes del método directo:
  • Se deben marcar todos los anticuerpos.
  • Proceso tedioso y costoso.
  • El marcaje puede alterar la inmunorreactividad.
• Ventajas del método indirecto:
  • No hay alteración del antisuero primario, lo que conserva su inmunorreactividad.
  • El antisuero secundario es específico para una Ig de una especie concreta, lo que permite detectar todos los anticuerpos primarios sin importar el antígeno que reconozcan.
  • Es un método más sensible.
• Desventaja del método indirecto:
  • Requiere de controles, ya que cada capa puede aumentar la señal inespecífica si el antisuero secundario se une a sitios no deseados.

Tipos de Moléculas para Marcar Anticuerpos

• Técnicas inmunoenzimáticas: Semejantes a la histoquímica enzimática.
• Fluorocromos: Para microscopía de fluorescencia.
• Oro coloidal: Partículas densas a los electrones, útiles en microscopía electrónica (ME). También se usan en microscopía óptica (MO) para precipitar sales de plata.

Técnicas Inmunoenzimáticas

• Utilizan el mismo principio que las técnicas de histoquímica enzimática.
• Enzimas más utilizadas como marcadores son:
  • Peroxidasa.
  • Fosfatasa alcalina.
• Se revelan utilizando el sustrato y cromógenos adecuados, generando productos insolubles de color marrón-negro, azul o rojo.
• Las enzimas endógenas, si son iguales al marcador, deben ser inhibidas.

Método General en Técnicas Inmunoenzimáticas

1. Hidratación del tejido en solución acuosa tamponada.
2. Inhibición de enzimas endógenas.
3. Bloqueo de sitios de unión inespecíficos con suero normal de una especie diferente a la del antisuero primario (generalmente la misma que la del secundario).
4. Incubación del tejido con el antisuero primario.
5. Lavado: elimina las Ig no unidas.
6. Incubación con el antisuero secundario.
7. Lavado: elimina las Ig no unidas.
8. Revelado: incubar la muestra con sustrato y cromógeno.
9. Tinción de contraste.
10. Montaje.

Técnica Inmunoenzimática: Peroxidasa

• Se inhibe la peroxidasa endógena aplicando una solución diluida del sustrato (H₂O₂).
• Incubación de la peroxidasa (no endógena) con H₂O₂ y una sustancia cromógena donadora de electrones (la más habitual es la diaminobencidina (DAB)).
• Por efecto de la peroxidasa, el H₂O₂ se reduce y el donador de electrones se oxida. Esta reacción se mejora con anticuerpos anti-peroxidasa (PAP), lo que aumenta la sensibilidad.

Técnica Inmunoenzimática: Fosfatasa Alcalina (APAAP)

• Técnica útil en tejidos con pigmentos, ya que estos interfieren en el resultado de la peroxidasa.
• Inhibición de la fosfatasa alcalina endógena (isoformas) con levamisol (excepto la intestinal).
• Técnica no recomendada en intestino.
• Se sigue el mismo método que para la peroxidasa.

Técnica de los Complejos Avidina-Biotina (ABC)

• Técnica muy utilizada.
• Avidina: glicoproteína. Biotina: vitamina.
• La biotina se une covalentemente a la avidina y a las inmunoglobulinas (Ig).
• Técnica de tres pasos, donde se utiliza un antisuero secundario biotinilado.
• Después del anticuerpo secundario, se añaden complejos avidina-biotina-peroxidasa.
• Proporciona una señal muy amplificada debido al gran tamaño del complejo ABC.
• Problema: La avidina puede generar marcaje inespecífico debido a lectinas endógenas. Esto se evita utilizando estreptavidina, que no está glicosilada.

Inmunomarcaje Múltiple

• Permite la detección de más de un antígeno en una sola preparación.
• Utiliza diferentes enzimas, fluorocromos u oro coloidal de distinto tamaño.
• Mediante técnica directa (1 anticuerpo → 1 color), pero con baja sensibilidad.
• En técnica indirecta, pueden ocurrir reacciones cruzadas (entre 1º-2º o 2º-2º). La solución es usar antisueros de especies distintas.

Estrategias para Anticuerpos Primarios de la Misma Especie

• ¿Qué hacer si no se pueden utilizar antisueros primarios de diferentes especies?
• Si los anticuerpos primarios son de la misma especie, se puede emplear un método secuencial para evitar reacciones cruzadas (dos opciones):
  • Bloqueo inmunológico de grupos que pueden generar reacción cruzada, bloqueando los sitios de unión libres del antisuero primario o secundario, mediante:
    • Suero normal de una determinada especie.
    • Fragmentos Fab (monovalentes) para Ig específicas de la especie utilizada.
    • Anticuerpos que reaccionan a antígenos no presentes en la muestra (pero sí con los que se han añadido).
  • Fragmentos Fab para “convertir” el anticuerpo primario de una especie en otra, por ejemplo:
    • Si el anticuerpo primario es de ratón, se incuba con fragmentos Fab de cabra que reaccionan al de ratón.
    • Ahora se detecta el de cabra, pudiendo usar un anticuerpo secundario marcado de conejo que reacciona al de cabra.
    • Luego se aplica el anticuerpo primario de ratón para el segundo antígeno y, posteriormente, el secundario anti-ratón marcado.
  • Incubar previamente el anticuerpo primario y secundario marcado y luego exponerlo a la muestra. Esto conlleva el peligro de reducir la inmunorreactividad (técnica en desuso).
• En reacciones múltiples, los controles son aún más importantes para controlar las reacciones cruzadas.

Factores que Afectan la Inmunorreactividad

Fijación e Inclusión

• La fijación afecta la antigenicidad al alterar las proteínas.
  • Para preservar la morfología: fijadores entrecruzantes.
  • Para preservar el antígeno: fijadores precipitantes (acetona o alcohol) o criostato.
• Inclusión: Una temperatura elevada puede disminuir la antigenicidad. Alternativas:
  • Parafina de bajo punto de fusión.
  • Criostato.
  • Técnica de pre-embedding:
    • Corte de 20-40 µm en vibrátomo o criostato.
    • Aplicación de la técnica.
    • Realización de la inclusión.
  • Generalmente se usan métodos de post-inclusión.

Desenmascaramiento de Antígenos

• Permite mostrar antígenos “escondidos” debido al proceso de fijación/inclusión.
• Este proceso se denomina recuperación antigénica.
• Se aplica a muestras fijadas con aldehídos (que forman puentes hidroximetileno), como el formol.
• Se desconoce el mecanismo de acción exacto de las técnicas utilizadas.
• Existen dos métodos para desenmascarar el antígeno:
  • Digestión enzimática (recuperación antigénica mediante proteólisis):
    • Incubar el corte (a 37 ºC) con una enzima proteolítica.
    • Puede destruir algunos epítopos y afectar la morfología tisular.
  • Calor: Calienta los cortes hidratados en solución acuosa a un pH determinado durante un tiempo variable. Las soluciones más utilizadas son:
    • Citrato a pH 6, Tris-EDTA a pH 9, Tris-HCl a pH 10.
      • Pueden usarse a diferentes pH y con detergente.
    • Se realiza en microondas, olla a presión, autoclave o baño María. Los aparatos de laboratorio proporcionan un mejor control.

Controles en Inmunohistoquímica

• Garantizar la especificidad.
• Evitar falsos positivos.
  • Asegurar que no hay autofluorescencia o pigmentos endógenos.
• La especificidad de los resultados depende de:
  • La especificidad del antisuero primario.
  • La especificidad de la técnica inmunohistoquímica.

Antisuero Primario: Causas de Tinción Inespecífica

• Causas de tinción inespecífica:
  • Alta heterogeneidad de las Ig en el antisuero policlonal.
    • Reacción cruzada con antígenos que poseen epítopos similares.
    • Se evita incubando el antisuero con antígenos que puedan generar reacción cruzada.
  • Reacción de Ig con la molécula transportadora (carrier).
    • Utilizar una molécula transportadora que no esté presente de forma natural en el tejido a estudiar.
  • Unión inespecífica por interacciones electrostáticas, hidrofóbicas o con receptores de la fracción Fc de la Ig en el tejido.
    • Uso de suero no inmune de una especie distinta para bloquear los sitios inespecíficos.
    • Añadir detergente a baja concentración después de la incubación (durante el lavado), ya que las uniones inespecíficas son más débiles que las uniones antígeno-anticuerpo (Ag-Ac).
  • Presencia de Ig endógenas reconocidas por el antisuero secundario.
    • Bloquear las Ig endógenas antes de la incubación.

Control Positivo

• Utilizar una muestra que se sabe que presenta el mismo antígeno y que ha sido procesada de la misma manera.
• Utilizar un control positivo para cada antisuero primario empleado.
• Realizar la preparación de control y la de interés en paralelo.
• Si el control positivo no da resultado, indica un error durante el procedimiento, lo que invalida el resultado.

Control Negativo

• Realizar la técnica omitiendo algún paso.
  • Realizar el revelado sin pasos previos: esto mostrará la presencia de actividad endógena.
  • Sustituir el antisuero primario por suero no inmune de la misma especie (si es monoclonal, de la misma especie pero que no reconozca el antígeno) y del mismo isotipo (ej. IgA).
  • No añadir antisuero secundario o complejos (ej. ABC).