Fundamentos de Microbiología: Esterilización, Manejo de Material y Cinética de Crecimiento Bacteriano

Indicadores Biológicos de Esterilización

Son sistemas generalmente comercializados en forma de cápsulas cerradas en cuyo interior hay esporas de resistencia a la esterilización conocida. Dichas ampollas, tras haber sido sometidas a condiciones de esterilización, se incuban a 56 °C (en caso de cápsulas con Bacillus stearothermophilus) o a 40 °C (en caso de cápsulas con Bacillus subtilis).

Al cabo de 24-48 horas, se procede a su lectura, donde la germinación y el cambio de color indicarán que no se han producido condiciones de esterilización adecuadas.

Sistema de Vial de Polipropileno

Uno de los sistemas biológicos más utilizados consiste en un vial de polipropileno, en cuyo interior se encuentra:

• Un filtro de papel hidrófobo con esporas desecadas.
• Una ampolla de vidrio que contiene un medio de cultivo líquido con un indicador de pH (púrpura de bromocresol).

El sistema se somete a esterilización, según el protocolo de laboratorio, y se coloca en el lugar donde es más difícil que llegue el vapor. Una vez realizado el proceso, se rompe la ampolla de vidrio, poniendo en contacto las esporas con el medio, y se incuba. Al cabo de 24 horas se observan los resultados:

• El medio inicialmente presenta un color violeta.
• La esterilización es correcta si se mantiene el mismo color que al comienzo.
• La germinación de las esporas (si la esterilización falló) provocará un cambio de color debido a la producción de ácido.

5. Limpieza y Manejo del Material de Laboratorio

Distinguiremos dos tipos de material, según su peligrosidad:

Material de Escaso Riesgo

Es aquel que no ha contactado con ninguna fuente de microorganismos o con ningún tipo de muestra.

1. Se lavará tras su utilización con agua y jabón, con ayuda de estropajos y/o escobillones.
2. Se enjuagará con agua corriente varias veces, hasta eliminar todo el jabón.
3. Se realiza el último enjuague con agua destilada.
4. Se deja secar al aire o se lleva a la estufa Pasteur (50-60 ºC). Posteriormente, se esteriliza o se guarda.

Advertencia sobre el Agar

No verter nunca el agar licuado en las tuberías de la red de desagüe, ya que al solidificar las obturaría. Este material se eliminará siempre como material sólido.

Material de Elevado Riesgo

Material que se encuentra potencialmente contaminado con microorganismos, es decir, el que ha podido estar en contacto con muestras, por lo tanto, es material con riesgo potencial de contagio.

Lo primero que necesitamos es esterilizar o desinfectar. ¿De qué depende que se desinfecte o se esterilice? Depende del tipo de material. Por una parte, se puede desechar y, por otra, si es reciclable, se recicla (en caso de material de escaso riesgo).

1. Esterilización Post-uso

Generalmente se realiza en autoclave. Si es material reciclable que no es susceptible a la esterilización, se desinfectará (por ejemplo, con hipoclorito sódico, a ser posible 1 hora mínimo en inmersión).

Las placas Petri se colocarán en una bolsa de esterilización y se ubicarán en un cestillo ciego dentro del autoclave, ya que durante el proceso las placas se derriten, derramando el medio de cultivo.

2. Limpieza Propiamente Dicha

Igual que el material de escaso riesgo, ya que lo hemos convertido en este tipo de material mediante la esterilización post-uso.

Esterilización Pre-uso

Tras la limpieza, todo material de uso aséptico debe esterilizarse de nuevo:

• Pipetas: Se tapa la boquilla con algodón graso y se envuelven con papel de aluminio, indicando dónde se encuentran las puntas para saber por dónde deben abrirse, el tipo de pipeta que contiene, el número y la fecha de esterilización o caducidad, que será de 3 meses. Se esterilizan en horno Pasteur o autoclave.
• Recipientes de vidrio: Se tapa la boca con algodón graso. Si presentan rosca, esta estará a medio cerrar y el conjunto o la boca se envuelven con papel de aluminio, identificándolos igual que en el apartado anterior. Se esterilizan en autoclave u horno Pasteur.

Crecimiento Bacteriano, Medios de Cultivo y Técnicas de Siembra

1. Introducción al Crecimiento Bacteriano

En un ambiente favorable, una célula microbiana aumenta su tamaño y, cuando este se duplica, la célula se divide, generalmente por bipartición, dando lugar a dos células hijas genéticamente idénticas.

El crecimiento de una población de células tiene un ritmo exponencial. La célula bacteriana se divide en dos, y cada célula hija se divide a su vez produciendo dos nuevas células, de modo que en cada periodo la población se duplica.

2. Fases de Crecimiento

Cuando se inoculan las bacterias en un medio de cultivo líquido, irán creciendo de forma exponencial hasta que el desarrollo celular se vea limitado por algún factor: agotamiento de sustancias nutritivas, acumulación de sustancias tóxicas, descenso del pH, agotamiento del oxígeno, etc.

Si representamos gráficamente el logaritmo del número de células viables frente al tiempo, obtenemos una curva de crecimiento típica de aspecto sigmoidal, que nos permite diferenciar varias fases de crecimiento:

• Fase de latencia o lag
• Fase exponencial o log
• Fase estacionaria
• Fase de muerte

Parámetro de medida: log N (N = Número de células en el cultivo). T = Tiempo de cultivo.

1. Fase de Latencia (Lag)

Es el tiempo necesario para la adaptación al nuevo medio donde se siembran. Durante este periodo, los microorganismos aumentan su actividad metabólica, se embeben en agua, incrementan la tasa de ARN (esencial para la síntesis de nuevas proteínas bacterianas) y se producen nuevos enzimas. La duración de la fase de latencia depende sobre todo del cultivo previo, de la edad del inóculo, así como de lo apropiado que sea el medio de cultivo.

2. Fase Exponencial o Logarítmica

Cuando los microorganismos se han adaptado, se inicia esta fase en la que la población bacteriana se duplica de forma importante y el número de células muertas es mínimo. La actividad metabólica en esta fase es máxima, el tamaño medio bacteriano no se reduce, las estructuras (pared, membrana, etc.) presentan un espesor mínimo, la sensibilidad a los agentes antimicrobianos es óptima, y las características bioquímicas y fisiológicas son más evidentes. (Ejemplo: E. coli: 18 min en el laboratorio – 12 h en nuestro intestino).

3. Fase Estacionaria

Es el periodo durante el cual la tasa de crecimiento disminuye y el número de divisiones es igual al número de muertes, con lo que la población permanece constante.

En un recipiente de cultivo cerrado, una población no puede crecer indefinidamente a ritmo exponencial. La limitación del crecimiento se produce o bien porque se agota el suministro de un nutriente esencial o bien porque se acumula algún producto metabólico tóxico.

4. Fase de Muerte

Al volverse las condiciones del medio más adversas, las bacterias se reproducen más lentamente hasta que cesa y predominan las células muertas. Aparece una fase de declinación exponencial similar, pero en sentido contrario, a lo que sucede en la fase logarítmica.

En la mayor parte de las bacterias, el proceso se desarrolla en 72 horas, de forma que al final de estas el número de microorganismos viables es muy pequeño.

Tasa de Crecimiento

Es el número de generaciones por hora.

Crecimiento de una Colonia

Cuando una población se desarrolla a partir de una única célula en una superficie sólida, forma una masa de células denominada colonia. Las distintas especies de microorganismos forman colonias con diferentes formas y texturas.

3. Cultivo de Microorganismos

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada (les proporciona los nutrientes necesarios y el ambiente adecuado para su crecimiento). En general, podemos distinguir:

• Cultivos líquidos y sólidos (en función de las características del medio).
• Cultivos discontinuos y continuos (en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio).

4. Medios de Cultivo

Para que una bacteria pueda vivir y reproducirse debe disponer de los nutrientes necesarios; el conjunto de estos origina el medio de cultivo.

Los nutrientes necesarios para el crecimiento varían ampliamente entre los microorganismos. Hay algunos que para su crecimiento solamente requieren los nutrientes básicos.

Un medio de cultivo debe aportar a la bacteria todos los nutrientes necesarios para la síntesis de sus componentes celulares. Así pues, todo medio de cultivo debe contener:

• Agua
• Fuente de carbono: Glucosa, lactosa, etc.
• Fuente de nitrógeno: Amoniaco, nitratos, etc.
• Iones: Fosfato, sulfato, cloruros, etc.
• Otros oligoelementos: Zinc, cobre, etc.

La mayoría de bacterias y hongos de interés en patología humana crecen con mayor o menor facilidad en medios de cultivo artificiales. Hay, sin embargo, algunas bacterias cuyo cultivo solo es posible en presencia de células vivas (Rickettsias) y otras cuyo cultivo no se ha conseguido aún (M. leprae: agente etiológico de la lepra).

Hay bacterias que son incapaces de sintetizar algunos de los metabolitos esenciales para su crecimiento, por lo tanto, es necesario añadirlos al medio. Se definen como factores de crecimiento y son:

• Vitaminas: actúan como coenzimas.
• Aminoácidos: precursores de las proteínas.
• Bases púricas y pirimidínicas: precursoras de los ácidos nucleicos.
• Otros: como los factores V y X, presentes en la sangre.

Cultivo Puro (Axénico)

Para el estudio de un microorganismo en el laboratorio es necesario aislarlo, ya que se encuentran generalmente en comunidades más o menos complejas. Así, denominamos cultivo puro a aquel en el que solo ha crecido un tipo de microorganismo.

5. Composición de los Medios

Los constituyentes más utilizados en los medios son:

• Agar: Se presenta en gránulos o polvo. Es la sustancia que se utiliza en los medios de cultivo para solidificarlos (especie de gelatina).
• Peptona: Producto de composición variable, obtenido mediante hidrólisis a partir de proteínas animales o vegetales (por ejemplo: hígado, músculo, sangre, leche, etc.).
• Carne: El corazón de buey, el músculo y el hígado son utilizados frecuentemente; también se utilizan cerebro, placenta o el bazo de ternera.
• Extracto de carne: Contiene bases orgánicas solubles, productos de degradación de las proteínas, vitaminas y minerales.
• Extracto de levadura: Se consigue a partir de levadura de pan o de cerveza y es una fuente rica en aminoácidos y vitaminas.
• Sangre: Debe estar libre de agentes antimicrobianos para no inhibir el crecimiento. La más utilizada es la de carnero y caballo.
• Bilis: Contiene varios ácidos biliares y pigmentos como bilirrubina.
• Sales biliares: Son extraídas de la bilis, inhiben el crecimiento de Gram positivos (G+).
• Carbohidratos: Se utilizan para enriquecer los medios, promover el crecimiento o la pigmentación y determinar la producción de ácido y/o gas.
• Indicadores: Se incorporan a los medios para dar prueba visual del pH y otros cambios producidos durante el crecimiento.

6. Condiciones Ambientales Idóneas para su Cultivo

Incluso cuando se hallan presentes todas las sustancias nutritivas requeridas, el crecimiento y desarrollo de los microorganismos depende de determinadas condiciones del medio para vivir:

1. Temperatura

Cada especie bacteriana tiene una temperatura óptima para el crecimiento. En función de esta temperatura óptima, las bacterias se clasifican en:

• Mesófilas: la temperatura óptima oscila entre 20 y 45 ºC.
• Psicrófilas: la temperatura óptima está por debajo de los 20 ºC.
• Termófilas: su crecimiento es óptimo a temperaturas comprendidas entre 55 y 80 ºC.

2. pH

El pH óptimo para el crecimiento bacteriano depende de la especie, pero cada una de ellas crece en un intervalo relativamente estrecho, normalmente próximo a la neutralidad. Para disminuir los cambios de pH, en medios definidos se suele utilizar sistemas amortiguadores.

Para regular el pH óptimo de un medio, utilizaremos un ácido si lo que nos interesa es disminuir el pH, y por el contrario una base, si lo que interesa es aumentarlo.

3. Presión Osmótica

Generalmente se suelen cultivar en condiciones de isotonía, pero hay algunas que pueden crecer a concentraciones más altas, son las denominadas halófilas u osmófilas.

4. Presencia de Oxígeno

Todas las bacterias aerobias obligadas necesitan oxígeno como aceptor final de electrones. En los medios de cultivo líquidos, estas bacterias solo crecen en la superficie, ya que a medida que se desciende hacia el fondo del recipiente la concentración de oxígeno va disminuyendo.

Por el contrario, en el caso de bacterias anaerobias estrictas, el oxígeno atmosférico ha de excluirse del medio, pues resulta tóxico para ellas. Esto se consigue utilizando frascos en los que se ha hecho el vacío, medios que absorban el oxígeno o medios reductores (tioglicolato, cisteína).

Según el último aceptor de electrones, las bacterias se dividen en:

• Aerobias: El último aceptor de electrones es el oxígeno. Necesitan obligatoriamente oxígeno para vivir.
• Anaerobias: El último aceptor de electrones es una molécula diferente al oxígeno. El O₂ es letal (ausencia de O₂).
• Anaerobias Facultativas: Pueden utilizar tanto el oxígeno como otra molécula. No importa si hay O₂ o no.

5. Presencia de CO₂

Todas las bacterias requieren la presencia de pequeñas cantidades de dióxido de carbono para su crecimiento, que normalmente proviene de la atmósfera o de reacciones de oxidación/fermentación de la propia célula. Sin embargo, existen otras bacterias, como Brucella, que requieren concentraciones mayores de este compuesto, entre el 5 y el 10%; en este caso debe ser suministrado al medio de incubación.

Microaerófilas

Son las que necesitan una concentración determinada de CO₂ para vivir.

6. Hidratación

Las bacterias están constituidas por una elevada proporción de agua (80%) y precisan, además, un ambiente húmedo para su desarrollo. La desecación es letal para muchos microorganismos. Las bacterias esporuladas son las únicas que pueden sobrevivir en ambientes secos durante largos periodos de tiempo.

7. Clasificación de los Medios de Cultivo

Los medios de cultivo se pueden clasificar según:

1. Su Composición

• Naturales: Están constituidos por sustancias naturales (patata, extracto de carne, etc.).
• Sintéticos: En su composición aparecen sustancias químicas definidas.
• Semisintéticos: En su composición aparecen moléculas naturales hidrolizadas.

2. Su Consistencia

• Líquidos: Los nutrientes se encuentran disueltos en una solución acuosa. Se denominan caldos. Ejemplo: Caldo cerebro-corazón. Se utilizan para favorecer el crecimiento de microorganismos que se encuentren en pequeña cantidad, para el estudio del tipo respiratorio y de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos.
• Sólidos: Son medios líquidos a los que se añade una sustancia solidificante. La más ampliamente utilizada es el agar (se añaden 15-20 g/l). Ejemplo: Agar sangre, agar chocolate, etc. En los medios sólidos los microorganismos crecen formando colonias (poblaciones bacterianas que surgen de un único microorganismo), cuyas características morfológicas son importantes para su identificación.
• Semisólidos: Son medios líquidos a los que se añade una cantidad de agar más baja que a los medios sólidos (suele añadirse 5-10 g/l). Se utilizan para conocer la movilidad de los microorganismos.

3. Su Aplicación

• Medios Ordinarios o Generales: Son medios que en su composición solo tienen los componentes básicos, sin ningún factor de crecimiento adicional. Ejemplo: Agar nutritivo. Se utilizan cuando en el producto patológico a sembrar se sospechan gérmenes sin exigencias nutritivas especiales (Ejemplo: Enterobacterias, Pseudomonas, etc.). Sin embargo, son numerosas las especies bacterianas que sembradas en medios ordinarios no crecen o proliferan tan pobremente que su aislamiento e identificación resulta difícil o imposible.
• Medios Enriquecidos: Son medios ordinarios a los que se añaden ciertas sustancias (suero, sangre, Vitamina K, extracto de levaduras, etc.) que aportan los factores de crecimiento necesarios para el cultivo de determinados microorganismos (N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae, etc.).

Ejemplos de Medios Enriquecidos:

• Agar sangre: Agar normal al que se le añade sangre.
• Agar chocolate: Agar normal al que se le añade sangre hemolizada.
• Caldo tioglicolato: Medio líquido general al que se le añade tioglicolato.

En estos medios crecen no solo los gérmenes exigentes para cuyas necesidades se ha ideado el medio, sino también los gérmenes menos exigentes que crecerían en medios ordinarios. Así pues, en ellos crece la mayor parte de bacterias y hongos que pueden encontrarse en un producto patológico.

• Medios Diferenciales o de Aislamiento: Son medios que en su composición contienen sustancias e indicadores que permiten diferenciar unos microorganismos de otros, basándose en sus propiedades metabólicas. Un medio muy utilizado en microbiología clínica es el medio de MacConkey que contiene, entre otras sustancias, lactosa y un indicador de pH. Si la bacteria al proliferar metaboliza la lactosa, produce ácido que se pone de manifiesto por el viraje del indicador. Así, en este medio, las colonias de bacterias fermentadoras de lactosa toman color, mientras que las colonias de Salmonella, que no utilizan la lactosa, no toman color.
• Medios Selectivos e Inhibidores: Son medios sólidos que contienen sustancias (colorantes, antibióticos, sales biliares, etc.) que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, además de contener las mismas sustancias que los medios diferenciales. Así, según los inhibidores presentes, se seleccionarán unas u otras especies.

Ejemplos de Medios Selectivos:

• Agar MacConkey: Contiene sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de las bacterias Gram positivas.
• Agar Sangre CNA: Contiene Colistina y Ácido Nalidíxico para inhibir los gérmenes Gram negativos.

• Medios Especiales: Se utilizan para el desarrollo de una determinada especie cuando el médico lo solicita específicamente.

Ejemplos de Medios Especiales:

• Lowenstein-Jensen para el aislamiento de M. tuberculosis.
• Bordet-Gengou para el aislamiento de B. pertussis.

• Medios de Transporte y Mantenimiento: Se utilizan en la recogida, transporte y conservación de muestras biológicas. Esencialmente, son medios no nutrientes, semisólidos muy reductores, que inhiben las reacciones enzimáticas autodestructivas dentro de las células y evitan los efectos letales de la oxidación. No deben potenciar el crecimiento.

Muchos de los medios de cultivo utilizados en microbiología clínica cumplen más de un cometido. Muchos son selectivos y diferenciales (Agar MacConkey, Agar SS, etc.), o enriquecidos, selectivos y diferenciales (Agar Sangre CNA), etc.

8. Selección de Medios para el Cultivo de una Muestra

Cuando vayamos a realizar un cultivo de un producto patológico, seleccionaremos los medios más adecuados para el aislamiento de los posibles agentes patógenos implicados en el proceso.

Los medios a utilizar estarán en función de:

• Tipo de proceso patológico.
• Sospecha clínica.
• Tipo de muestra.
• Resultados del examen en fresco y/o tinción.