Fundamentos y Técnicas de la Tecnología del ADN Recombinante

Introducción al ADN Recombinante

El ADN recombinante es una molécula de ADN artificial formada por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que, normalmente, no se encuentran juntos. La técnica del ADN recombinante consiste en tres pasos fundamentales:

• 1) Aislamiento del gen que queremos introducir.
• 2) Inserción del gen en un transportador (formación del ADN recombinante).
• 3) Inserción del ADN recombinante en el nuevo organismo.

El Proceso de Clonación Molecular

El procedimiento detallado se desarrolla de la siguiente manera:

1. Los fragmentos de ADN se generan utilizando unas enzimas denominadas endonucleasas de restricción, que reconocen y cortan las moléculas de ADN por secuencias nucleotídicas específicas.
2. Los fragmentos producidos mediante la digestión con enzimas de restricción se unen a otras moléculas de ADN que sirven de vectores. Los vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped y facilitan la manipulación de la molécula de ADN recombinante recién creada.
3. La molécula de ADN recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de ADN insertado, se transfiere a una célula huésped. Dentro de esta célula, la molécula de ADN recombinante se replica, produciendo docenas de copias idénticas conocidas como clones.
4. Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el ADN recombinante, creando una población de células idénticas que llevan toda la secuencia clonada.
5. Los segmentos de ADN clonados pueden recuperarse de las células huésped, purificarse y analizarse.
6. El ADN clonado puede transcribirse, su ARNm puede traducirse y el producto génico puede aislarse y examinarse.

Clivaje y Reasociación del ADN: Enzimas de Restricción

Las enzimas de restricción (endonucleasas de restricción) reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido nucleico invasor. Estas enzimas reconocen una secuencia específica de nucleótidos, denominada sitio de restricción, en una molécula de ADN de doble cadena y cortan el ADN en esa secuencia.

Tipos de Enzimas de Restricción

Existen dos tipos principales según el extremo que generan al cortar:

• Enzimas de Tipo I (Extremo Romo): Cortan las dos cadenas del ADN en una posición aleatoria a cierta distancia del sitio de restricción. No se utilizan normalmente en la investigación de ADN recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.
• Enzimas de Tipo II (Extremo Cohesivo): Reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la molécula de ADN con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida. Se usan ampliamente en investigación puesto que permiten generar extremos compatibles. Pueden dejar salientes 3′ o 5′.

Por ejemplo, la enzima EcoRI corta las cadenas de manera escalonada, dejando extremos de cadena sencilla. Estos extremos son pegajosos (cohesivos) y pueden unirse a colas complementarias de otros fragmentos de ADN mediante puentes de hidrógeno. Posteriormente, se utiliza la enzima ADN ligasa para unir covalentemente los esqueletos azúcar-fosfato de los dos fragmentos.

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR es la amplificación de ADN in vitro por medio de la polimerización en cadena utilizando un termociclador, una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo. Su propósito es realizar muchas copias de un fragmento específico de ADN a partir de poco material disponible.

Pasos Básicos de la PCR

Se repiten de 25 a 40 veces:

1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de ADN en hebras sencillas, típicamente a una temperatura de 95 °C – 97 °C.
2. Apareamiento (Annealing): Los cebadores o primers se unen a la hebra sencilla de ADN en lugares específicos por complementariedad de bases (ej. 55 °C). La hibridación debe ser completa (100% de complementariedad).
3. Polimerización o Extensión: La Taq polimerasa extiende los primers colocando desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) en sentido 5′ a 3′, leyendo el ADN de 3′ a 5′. Se efectúa generalmente a 72 °C.

Reactivos Necesarios

• Amortiguador (Buffer): Generalmente compuesto de Tris-HCl (pH 8).
• MgCl2: Cofactor esencial para la polimerasa.
• dNTPs: dATP, dGTP, dCTP y dTTP.
• Cebadores (Primers): Secuencias cortas (20-24 nucleótidos).
• ADN molde: La secuencia que se desea amplificar.
• Polimerasa: Generalmente la Taq pol (de Thermus aquaticus), resistente al calor.
• Adyuvantes: Como BSA o glicerol para mejorar el rendimiento.

Observación y Análisis de Fragmentos de ADN

Electroforesis en Gel

Técnica para separar moléculas basándose en su tamaño y forma mediante un campo eléctrico. El ADN, cargado negativamente por los grupos fosfato, migra hacia el polo positivo.

Pasos de la Electroforesis:

1. Se utiliza un gel de agarosa (matriz porosa).
2. Se cargan las moléculas de ADN en el gel.
3. Se aplica el campo eléctrico; los fragmentos más pequeños migran más rápido y lejos.
4. Se agregan marcadores de frente de corrida (azul de bromofenol) para monitorear el avance.
5. Se incluye un marcador de peso molecular con bandas de tamaño conocido.
6. Se tiñe el gel con bromuro de etidio o SYBR Safe y se visualiza con luz UV.
7. Se calcula el tamaño de los fragmentos graficando la migración frente al logaritmo de los pares de bases.

Southern Blot

Método para detectar secuencias específicas de ADN en una mezcla compleja.

Pasos del Southern Blot:

1. Digestión del ADN y separación por electroforesis.
2. Desnaturalización del ADN en el gel (con NaOH o calor).
3. Neutralización con un buffer adecuado.
4. Transferencia: El ADN se traslada a una membrana de nitrocelulosa (calco del gel).
5. Fijación: El ADN se une irreversiblemente a la membrana mediante calor o UV.
6. Hibridación: Se expone la membrana a una sonda (ADN o ARN marcado) complementaria al gen de interés.
7. Revelado: Se detecta la señal (ej. autorradiografía si la sonda es radiactiva).

Vectores de Clonación y Expresión

Un vector es una molécula de ADN que transporta una secuencia de interés de un organismo a otro.

Tipos de Vectores

• Vectores de Clonado: Utilizados para generar múltiples copias del gen. Requieren un origen de replicación (ori), un sitio de múltiple clonado (SMC) y un marcador de selección (gen reportero).
• Vectores de Expresión: Además de lo anterior, poseen elementos para producir la proteína: promotor, sitio de terminación, sitio de unión a ribosomas (secuencia Kozak/ATG) y sitio de poliadenilación.

Vectores Disponibles

• Plásmidos: ADN circular extracromosómico (3-10 kb). Fáciles de manipular pero con capacidad limitada (hasta 4 kb de inserto).
• Fagos (Bacteriófagos): Virus que infectan bacterias (ej. Fago λ, M13). Permiten clonar segmentos más grandes.
• Cósmidos: Híbridos entre plásmidos y extremos COS del fago λ.
• BACs y YACs: Cromosomas artificiales de bacterias y levaduras, respectivamente. Los YACs permiten clonar hasta un millón de pares de bases.

Métodos de Introducción de Vectores

Conjugación

Proceso natural de transferencia de plásmidos entre bacterias mediante contacto directo (pilus). Requiere plásmidos conjugativos y un origen de transferencia.

Transformación

Captación de ADN desnudo del ambiente. Las células deben ser competentes. Puede ser:

• Química: Uso de CaCl2 y choque térmico.
• Electroporación: Aplicación de pulsos eléctricos para crear poros en la membrana.

Transformación en Plantas

• Agrobacterium tumefaciens: Utiliza el plásmido Ti para transferir ADN-T al genoma vegetal. Se usa en técnicas como el floral dip.
• Biobalística (Pistola génica): Disparo de micropartículas de oro cubiertas de ADN.

Transducción e Infección

• Transducción: Introducción de ADN mediante un virus o fago (ciclo lítico o lisogénico).
• Infección: Término utilizado para la introducción de ADN viral en células eucariotas animales.

Transfección

Introducción de material genético en células eucariotas (especialmente mamíferos). Puede ser:

• Transitoria: El ADN no se integra y se pierde en la mitosis.
• Estable: El ADN se integra en el genoma, permitiendo su herencia a la progenie mediante presión selectiva.