Protocolos de Esterilización y Desinfección en el Laboratorio de Microbiología

Esterilización, Desinfección y Limpieza de Material

1. Introducción

En el laboratorio de microbiología es necesario trabajar en ausencia total de microorganismos para evitar posibles contaminaciones. Por ello, se recurre a distintos métodos, que son técnicas destinadas a eliminar estos microorganismos. Se ha comprobado que la simple limpieza no es suficiente para este propósito, por lo que debemos recurrir a otras técnicas:

• Desinfección
• Esterilización

2. Desinfección

La desinfección incluye todas las técnicas que destruyen los microorganismos patógenos, pero no sus formas de resistencia (esporas).

La acción germicida puede ser:

• Bactericida: Actúa sobre las bacterias produciendo su muerte.
• Fungicida: Actúa sobre los hongos produciendo su muerte.
• Viricida: Actúa sobre los virus produciendo su muerte.

Si solo inhiben el crecimiento, pero no los destruyen, hablaremos de: Bacteriostático, fungiostático o virostático.

2.1. Desinfección por Métodos Físicos

Pueden utilizar el calor o las radiaciones ultravioletas como agentes desinfectantes, siendo los primeros los más utilizados.

• Ebullición

  Tratamiento con agua a 100 °C. Consiste en introducir el material en agua hirviendo (100 °C) durante unos 10 minutos como mínimo.

• Radiaciones Ultravioletas

  Actúan a nivel genético, impidiendo la duplicación del ADN. Son radiaciones poco penetrantes, su acción es superficial. Se utilizan para la reducción del nivel de microorganismos (MO) en ambientes estériles (por ejemplo, quirófanos).

2.2. Desinfección por Métodos Químicos

Se definen como aquellos métodos de desinfección que utilizan sustancias químicas de naturaleza y propiedades muy diversas para conseguir la eliminación de los gérmenes patógenos.

• Desinfectantes

  Son sustancias que se aplican sobre material inerte sin alterarlo de forma apreciable, con el fin de destruir los MO. Para que sea un buen desinfectante tiene que cumplir una serie de condiciones.

• Antisépticos

  Son sustancias químicas de aplicación tópica sobre los tejidos vivos (piel, mucosas, heridas, etc.) que destruyen o inhiben el crecimiento de los MO sin afectar a los tejidos sobre los que actúan (ejemplo: Betadine).

Diferencia Clave

Todos los antisépticos pueden ser desinfectantes, pero no todos los desinfectantes pueden ser antisépticos.

Características de los Desinfectantes

• Poder germicida lo más alto posible y amplio espectro de acción a bajas concentraciones.
• No ser tóxicos para el hombre, ni corrosivos para el material.
• Poseer alto poder de penetración, soluble en agua y en fluidos tisulares.
• Económico, de fácil aplicación y adquisición.
• Inerte.
• Estable en su composición habitual.

Formas de Administración de los Desinfectantes

• Loción.
• Inmersión.
• Pulverización.
• Aspersión.

Los Desinfectantes más Utilizados

• Derivados de Amonio Cuaternario

  Se pueden utilizar diluidos al 1% para la desinfección de manos. Su uso más corriente es para la limpieza-desinfección de paredes, suelos, ropa y objetos en general (ejemplos: Cloruro de benzalconio, Cetrimida).

• Compuestos Fenólicos

  Son muy eficaces. Se suelen utilizar mezclas con derivados de amonio cuaternario para aumentar el espectro de acción y su poder de penetración (ejemplos: Hexacloroformo, Tricresol -Zotal-).

• Compuestos Clorados

  Son utilizados para desinfección de superficies, ropas, urinarios, etc. Se suelen usar diluidos en agua y un ejemplo típico lo constituyen las lejías (hipocloritos, cloramina).

Clasificación de Desinfectantes y Antisépticos Comunes

Alcoholes (A)

• Nombre Habitual: Alcohol etílico, Alcohol isopropílico.
• Forma de Utilización: Alcohol etílico 70º, Alcohol isopropílico 70º.
• Observaciones: No son efectivos contra las esporas ni ante muchos virus.

Aldehídos (A)

• Nombre Habitual: Formaldehído (formol), Glutaraldehído.
• Forma de Utilización: En solución acuosa hasta 40% (Normalmente 8%). Glutaraldehído al 2% (alcalina).
• Observaciones: Destruye formas vegetativas y virus. El formol es irritante de piel y mucosas.

Compuestos Clorados (D)

• Nombre Habitual: Hipocloritos (de superficie), Cloroazodina, Cloramina T, Succinilcloraminas.
• Forma de Utilización: Se utilizan en distintas concentraciones, según el uso.
• Observaciones: Son bactericidas y viricidas muy efectivos. Se utilizan para desinfección de suelos y agua. Son corrosivos con los metales.

Yodo (A)

• Nombre Habitual: Tintura de yodo.
• Forma de Utilización: En solución alcohólica con yoduro potásico del 2 al 5%. Solución acuosa al 2%.
• Observaciones: Son soluciones germicidas y tiñen la piel.

Compuestos Fenólicos (D)

• Nombre Habitual: Hexaclorofeno, Tricresol (Zotal).
• Forma de Utilización: Se utiliza en forma de jabón sólido al 1-3%. Se utiliza en solución jabonosa al 5%.
• Observaciones: El efecto bactericida se reduce a baja temperatura y en medio alcalino. Son eficaces en solución acuosa.

Yodóforos (A)

• Nombre Habitual: Povidona yodada.
• Forma de Utilización: Se utiliza entre 1 y 1,5%.
• Observaciones: Activos frente a bacterias. Efecto tuberculicida y baja toxicidad.

Ácido Fénico (A)

• Nombre Habitual: Ácido carbólico.
• Forma de Utilización: En solución al 2,5-5%. En pomada al 10%.
• Observaciones: Antiséptico poderoso, anestésico local. En estado puro es cáustico y muy venenoso.

Biguanidas (A)

• Nombre Habitual: Clorhexidina.
• Forma de Utilización: Se utiliza en solución acuosa y alcohólica mezclada con detergentes.
• Observaciones: Buen antiséptico. Se utiliza para el lavado de manos.

Derivados de Amonio Cuaternario (A)

• Nombre Habitual: Cloruro de benzalconio (manos), Cloruro de cetilpiridina, Cloruro de bencetonio.
• Forma de Utilización: Se utilizan en solución acuosa.
• Observaciones: Son inactivos frente a esporas y virus. Se utilizan como antisépticos tópicos.

Derivados Metálicos (A)

• Nombre Habitual: Mercurocromo.
• Forma de Utilización: Solución acuosa al 2%.
• Observaciones: Bacteriostáticos.

Colorantes Naturales (A)

• Nombre Habitual: Violeta de genciana.
• Forma de Utilización: Solución acuosa al 1%. Solución alcohólica al 0,2%.
• Observaciones: Propiedades bactericidas para Gram positivos (G+) y hongos.

Agua Oxigenada (A)

• Nombre Habitual: Agua oxigenada (Peróxido de hidrógeno).
• Forma de Utilización: Solución al 3%.
• Observaciones: Antiséptico débil.

Detergentes Aniónicos (A)

• Nombre Habitual: Laurilsulfato sódico, Tetradecilsulfato sódico.
• Forma de Utilización: En distintas concentraciones.
• Observaciones: Utilizados en pasta dentífrica. Esclerosante de venas varicosas.

3. Esterilización

La esterilización es una técnica de saneamiento preventivo que garantiza la eliminación total de todos los microorganismos (bacterias, hongos y virus) y sus formas de resistencia del material sometido a dicho proceso.

En función del agente esterilizante, los sistemas de esterilización pueden clasificarse en:

• Físicos
• Químicos
• Mecánicos

El mecanismo de destrucción de los microorganismos variará en función del método aplicado, y este se selecciona dependiendo de las características del material que se pretenda esterilizar. La esterilización es más rápida por calor húmedo que por calor seco, ya que interviene la temperatura y el vapor de agua.

3.1. Métodos Físicos

A) Calor Seco

Aplica el calor como esterilizante. Dependiendo de la temperatura y del tiempo de aplicación se consigue o no la esterilización. Las técnicas de esterilización por calor seco son:

• Flameado

  Consiste en exponer un objeto o parte de un material a la llama de un mechero durante uno o varios minutos, según el material de que se trate. Este método se utiliza para esterilizar:

  • Punta del asa de siembra (hasta incandescencia).
  • Las bocas de los tubos de ensayo o matraces cuando se abren y siempre antes de cerrarlos.
  • Puntas de pipeta, etc.

• Incineración

  Consiste en reducir a cenizas el material. Es utilizado para destruir material de un solo uso, por ejemplo, jeringas, guantes, catéteres, etc.

  Incinerador de Bacterias

  Se utiliza para esterilizar el asa o hilo de siembra con una resistencia eléctrica.

• Horno Seco, Estufa Pasteur u Horno Poupinel

  Son hornos metálicos con bandejas ajustables en su interior. Suelen calentarse mediante resistencias eléctricas, pudiendo regularse su temperatura. Externamente estas estufas presentan un termómetro que indica en todo momento la temperatura que existe en el interior del horno (que deberá coincidir con la temperatura elegida). También incluye un selector de temperatura y en ocasiones un reloj.

  La esterilización se consigue a:

  • 180 °C durante 1 hora.
  • 170 °C durante 2 horas.
  • 160 °C durante 3 horas.

  Este tipo de esterilización actúa sobre los materiales en profundidad.

  Procedimiento de Esterilización por Calor Seco

  1. Se preparan los instrumentos o materiales a esterilizar, los cuales deberán estar debidamente protegidos, identificados y con la indicación de la fecha de esterilización (por ejemplo, envolviéndolos en papeles especiales o colocándolos en el interior de cajas).
  2. Se introducen en la estufa y se conecta, seleccionando la temperatura en el termostato y el tiempo en el reloj (si lo hubiera). El tiempo comenzará a contabilizar cuando se alcance la temperatura seleccionada.
  3. Transcurrido el tiempo deseado a la temperatura elegida, se desconecta el interruptor y se deja descender la temperatura hasta unos 50-60 °C.
  4. Se abre la estufa y se recoge el material.
  5. Este material se considera que mantiene la esterilización durante 3 meses. Por ello, todo el material debe ir identificado y con fecha de esterilización.

  Los materiales que se pueden esterilizar por este método son todo tipo de materiales de vidrio, porcelanas, metal sin filo, etc. No se utiliza para esterilizar medios de cultivo, productos líquidos, telas o plásticos.

  Control y Mantenimiento

  1. No utilizar las estufas para el secado o tratamiento térmico de productos que puedan desprender vapores susceptibles de formar mezclas explosivas.
  2. No trabajar a una temperatura igual o inferior que la ambiental, ya que, en este caso, el termómetro regulador no funciona correctamente.
  3. Todas las regulaciones de temperatura deben hacerse en sentido ascendente (de menor a mayor temperatura).
  4. Controlar la temperatura del interior, pues la del exterior solo es orientativa. Se controlará cada día y en cada carga.

B) Calor Húmedo

Se diferencia del calor seco en que, en este método de esterilización, además del calor, interviene siempre el agua o vapor.

• Autoclave

  Es un recipiente cilíndrico grande o pequeño que se cierra herméticamente. Su poder de esterilización se debe al vapor de agua y se basa en la coagulación de las proteínas que componen el protoplasma celular.

  El autoclave es un aparato muy utilizado y sus propiedades esterilizadoras dependerán de las condiciones de presión y tiempo elegidos. Se conseguirá esterilización si sometemos el autoclave a:

  • 1,2 atmósferas durante 20 minutos (121 °C).
  • 2 atmósferas durante 10 minutos (134 °C).
  • 3 atmósferas durante 5 minutos (144 °C).

  Tiempos del Ciclo de Autoclave

  1. Tiempo de penetración: Tiempo necesario para que el material alcance la temperatura de esterilización.
  2. Tiempo de esterilización: Tiempo necesario para la esterilización (ejemplo: 15 min).
  3. Tiempo de seguridad: Tiempo que se añade como seguridad a la esterilización (ejemplo: 5 min).

• Vapor Fluente

  Consiste en utilizar el autoclave siguiendo la técnica habitual, pero con la llave de purga abierta, lo que impedirá que se produzca un aumento de presión y que la temperatura nunca sea superior a 100 °C. Este método es utilizado para materiales o medios que no puedan soportar temperaturas superiores a 100 °C (por ejemplo, los medios muy azucarados, para evitar su caramelización). Es un método poco usado en microbiología.

• Tyndalización

  Es un método de ebulliciones consecutivas para conseguir la esterilización. Se utiliza en microbiología cuando existe un problema de contaminación en algún material o en el propio autoclave. Consiste básicamente en ebulliciones repetidas a lo largo de unos 3 o incluso 4 días, hasta que se elimina el germen contaminante. Teóricamente no se deben alcanzar temperaturas por encima de los 100 °C y durante este intervalo no se debe abrir el aparato o recipiente que se somete a tyndalización. El objetivo de este método es destruir las esporas cuando estas germinan, así como evitar contaminaciones por microorganismos resistentes.

• Uperización (UHT)

  Es un método muy utilizado en la industria alimentaria. Consiste en tratar el alimento a una temperatura de unos 149-150 °C durante unos instantes (de 1 a 5 segundos). Su ventaja fundamental es que no se alteran las propiedades del alimento.

• Pasteurización

  No es un método de esterilización, ya que no destruye las formas de resistencia. Es utilizado en la industria alimentaria. Consiste en calentar el medio a temperaturas comprendidas entre 62 °C (30 minutos) y 72 °C (15 minutos).

C) Radiaciones Ionizantes

Las utilizadas en microbiología son:

• Rayos Ultravioleta (UV)

  Más que para esterilizar, se usan para mantener la esterilidad de superficies y/o recintos. Se caracterizan porque tienen poca penetración. Actúan impidiendo y alterando la duplicación del ADN celular. Se debe evitar su acción sobre la piel.

• Rayos Gamma (γ)

  Se utilizan para conseguir esterilización en frío. Son producidos por isótopos radiactivos. Presentan un poder de penetración muy alto, constituyendo el método de esterilización más utilizado a nivel industrial. Se utiliza para esterilizar materiales de uso único o desechable (guantes, jeringas, catéteres, prótesis, válvulas, etc.) y en general cualquier tipo de material que pudiera alterarse por calor.

D) Sistemas de Filtración

Son filtros que van a separar del medio a filtrar todas aquellas estructuras que sobrepasen un determinado tamaño, según el tamaño del poro. La efectividad de un filtro va a ser proporcional al tamaño del poro, pudiendo conseguirse la esterilización. Podemos aumentar el poder de esterilización con la presencia de presión, vacío e incluso la carga del filtro, que generalmente suele ser positiva, ya que las bacterias en medios neutros tienen carga negativa.

Campana de Seguridad Biológica

Utiliza filtros de membrana y corriente de aire para crear en su interior un ambiente estéril. Se utiliza cuando se trabaja con micobacterias.

3.2. Métodos Químicos de Esterilización

Sustancias químicas que producen esterilización. Los más empleados son:

• Óxido de Etileno (OE)

  Se emplea en forma de gas, mezclado con dióxido de carbono, ya que el óxido de etileno puro es muy oxidante y al mezclarse con el oxígeno del aire podría explotar. Presenta un gran poder de penetración y como método de esterilización es muy efectivo y duradero. La esterilización se va a producir a temperaturas bajas (de unos 55 °C) con una humedad relativa alta (40-60%) durante un tiempo medio de 11 horas. Para que todo esto suceda se requiere de cámaras o instalaciones específicas para ello, que son muy caras. El óxido de etileno se puede aplicar a cualquier material sensible al calor y que no pueda esterilizarse por otros métodos, por ejemplo, instrumentos de endoscopia, plásticos termolábiles, cauchos, material eléctrico, etc. El material estará disponible para ser utilizado a las 48 horas después de la esterilización. El material deberá conservarse estéril en el interior de una bolsa de plástico cerrada por procedimientos termoeléctricos. La duración de dicha esterilización es de unos 6 meses.

• Glutaraldehído Activado

  Es un producto líquido que se utiliza diluido al 20% y a pH alcalino. En esta solución se introduce el material limpio y se deja actuar unos 15-30 min. No es un método muy usado.

4. Controles de Esterilización

Los sistemas de control permiten comprobar la eficacia del proceso de esterilización.

4.1. Controles de Esterilización de Tipo Físico

Son sistemas de control incluidos en el aparato de esterilización. Estos pueden ser:

• Sistemas Mecánicos Oculares

  Tales como manómetros que miden la presión en el interior de la cámara.

• Vacuómetros

  Que miden el vacío en el interior de la misma. En ocasiones nos encontramos con sistemas que miden ambos parámetros.

• Termómetros

  Para indicar en cada momento del proceso la temperatura que hay en el interior.

La información que aportan solo indica las características y condiciones físicas del proceso o, lo que es lo mismo, el funcionamiento del esterilizador. Se emplean como orientativos de la calidad de esterilización dado que se conoce que, en esas condiciones ambientales de presión, temperatura y tiempo, se produce la destrucción de toda forma de vida. La información de temperatura y presión se muestra a lo largo del ciclo y se registra de forma digital, impresa en papel o representada en gráficas circulares o manualmente.

Registros Gráficos

Son representaciones gráficas estandarizadas que registran la evolución de los parámetros de presión y temperatura a lo largo del ciclo de esterilización. Se emplean de forma rutinaria en cada ciclo y, en una misma gráfica, se pueden registrar varios procesos.

4.2. Controles de Esterilización de Tipo Químico

Están basados en productos químicos comercializados generalmente sobre un soporte de cinta de papel. Dichos productos químicos actuarán como indicadores del proceso de esterilización, ya que por encima de una determinada temperatura cambian de color. Este hecho servirá para saber si las condiciones de esterilización han sido las previstas. También, según la fabricación y formulación, con este tipo de sistemas químicos se pueden conocer otros parámetros, aunque fundamentalmente se utilizan los de control térmico.

• Tiras Reactivas

  Son tiras impregnadas por un determinado compuesto químico, el cual vira de color tras haber sido sometido a las condiciones correctas de esterilización.

• Tubos de Brown

  Son tubos que contienen una sustancia indicadora líquida que cambia de color según la temperatura y tiempo de esterilización.

• Cintas Adhesivas

  Son controles químicos externos orientativos. Se emplean para cerrar los paquetes, generalmente textiles o de piezas sueltas de material, y son útiles tanto para la esterilización mediante vapor como para gas óxido de etileno (ejemplo: Cinta Minesota). Tienen que tener un cambio de color uniforme.

• Tiras de Papel

  Son dispositivos rectangulares que informan de forma precisa sobre los parámetros del ciclo de esterilización y están compuestos por una sustancia química que reacciona cambiando de color en determinadas condiciones ambientales. Se emplean como controles internos en esterilización por calor seco, calor húmedo y para gas OE (óxido de etileno). Se colocan en el lugar donde más dificultad tiene el agente esterilizante para llegar.

• Ensayo Bowíe & Dick

  Tiene por finalidad demostrar la ausencia de aire o cualquier otro tipo de gas distinto al vapor de agua que pueda impedir la rápida y uniforme penetración del vapor en toda la carga. Son hojas que llevan el químico; para que esté bien, tienen que estar las líneas de morado oscuro y el color uniforme. Se utiliza todos los días en la primera carga de autoclave vacía (134 °C, 5 minutos).

  Aplicación e Interpretación

  Se aplica al principio de la jornada tras el programa flash (cuando el autoclave está sin carga) para comprobar la «calidad del vapor». Cuando se alcanzan las condiciones de temperatura, presión y tiempo de exposición adecuadas, la sustancia indicadora experimenta un viraje de color para facilitar su interpretación.

  El vapor no apto para la esterilización es sobresaturado (húmedo) o sobrecalentado (seco) y da lugar a un viraje de color incompleto, que informa al personal sobre la existencia de anomalías en el vapor. En tal caso, es necesario revisar las condiciones técnicas del autoclave y el agua del interior del mismo, puesto que no se garantiza la eficacia del proceso de esterilización.