Fundamento: tinción Gram diferencial
Las diferencias químicas en las paredes celulares bacterianas determinan si el complejo cristal violeta-yodo permanece retenido o se elimina durante la decoloración.
Las bacterias Gram positivas tienen una pared celular gruesa, compuesta principalmente por peptidoglucano, mientras que en las Gram negativas la pared, aunque también constituida por peptidoglucano, es más delgada y presenta además una membrana externa con lipopolisacáridos.
Las paredes de las bacterias Gram positivas tratadas con alcohol sufren una deshidratación y sus poros se contraen, dificultando la salida del complejo cristal violeta‑yodo. En las Gram negativas el alcohol desorganiza la capa lipídica externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglucano.
Objetivo
Aprender una técnica de coloración diferencial e interpretar los resultados, distinguiendo bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Material
- Asa de siembra
- Portaobjetos
- Cultivos bacterianos
- Colorantes (cristal violeta, safranina)
- Solución de lugol (yodo)
- Etanol 95% (o alcohol-acetona para decoloración)
- Microscopio con objetivo de inmersión y aceite de inmersión
Técnica: tinción de Gram
Resultado esperado: Gram positivas retienen cristal violeta (color morado); Gram negativas no retienen y aparecen de color rosa (safranina).
- Teñir la extensión con la solución de cristal violeta durante 1 minuto.
- Lavar el exceso de colorante con agua.
- Cubrir la extensión con una solución diluida de yodo (lugol), que actuará como mordiente, durante 1 minuto.
- Lavar con agua el exceso de lugol.
- Decolorar con alcohol‑acetona cubriendo la preparación y dejando actuar durante 30 segundos.
- Lavar con abundante agua para eliminar el resto del disolvente.
- Contraste: colorear con safranina durante 1–2 minutos.
- Lavar con agua y dejar que la preparación se seque.
- Examinar las preparaciones al microscopio con aceite de inmersión, usando el objetivo de inmersión (sin cubreobjetos).
Tinción diferencial: tinción ácido-alcohol resistente (Ziehl–Neelsen)
Esta tinción permite distinguir bacterias cuyas paredes celulares contienen un elevado porcentaje de lípidos (ácidos micólicos), que las hacen impermeables a muchos colorantes y compuestos en solución acuosa. Estas características impiden que dichos microorganismos se tiñan adecuadamente con la tinción de Gram.
La tinción de Ziehl–Neelsen consigue que estas bacterias, una vez teñidas con fucsina fenicada, resistan la decoloración por ácidos y alcoholes. Por ello se denominan BAAR (bacterias ácido‑alcohol resistentes). El principal género bacteriano con esta propiedad es Mycobacterium spp.; Nocardia spp. y algunos Actinomyces spp. también presentan cierto grado de resistencia ácido‑alcohol.
Fundamento
Debido a la gruesa capa de compuestos lipídicos en su pared, se deben utilizar métodos especiales para favorecer la entrada del primer colorante (fucsina fenicada). Se calienta la preparación cubierta con este colorante durante un tiempo establecido; una vez que el colorante ha penetrado en la pared celular, la decoloración con ácido y alcohol es difícil y dichos microorganismos permanecen teñidos de rosa, mientras que el resto de las bacterias toman el colorante de contraste (azul de metileno).
Objetivo
Aprender la técnica de tinción ácido‑alcohol resistente, estudiar la morfología y propiedades de estos microorganismos y diferenciarlos de los que no son ácido‑alcohol resistentes.
Técnica (Ziehl–Neelsen)
- Preparar una extensión que contenga una mezcla de Staphylococcus aureus y Mycobacterium smegmatis, secar y fijar como se ha descrito previamente.
- Cubrir completamente la preparación con fucsina fenicada y calentar cuidadosamente a la llama de un mechero hasta emisión de vapores, evitando la ebullición. Se invierte el mechero y se pasa la llama bajo la preparación periódicamente. Esta operación se repite durante 5 minutos, añadiendo colorante conforme se evapora. La preparación no debe quedar seca en ningún momento. (En la tinción de Kinyoun, la fucsina fenicada modificada contiene una alta concentración de fenol que permite la entrada en la pared de micobacterias sin necesidad de calor.)
- Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
- Decolorar con alcohol clorhídrico, dejándolo actuar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
- Lavar nuevamente con agua y aplicar el colorante de contraste: azul de metileno durante 1 minuto.
- Lavar con agua el exceso de colorante y secar la preparación como se ha indicado anteriormente.
- Examinar la muestra teñida al microscopio con el objetivo de inmersión. Los bacilos ácido‑alcohol resistentes son largos y finos y aparecerán en grupos, teñidos de color rojo; las células que no son ácido‑alcohol resistentes aparecerán de color azul tras la tinción de contraste.
Ejemplo de aplicación clínica: Mycobacterium tuberculosis se detecta en muestras patológicas como esputos y secreciones bronquiales mediante esta técnica.