Factores que influyen en la cromatografía en columna


Extracción de lípidos


Utiliza el procedimiento de folch que usa Una mezcla de cloroformo y metanol. Los lípidos son solubles en cloroformo, Este se elimina recuperando los lípidos

. Extracción de ADN

Se añade una solución de lisis que degrada proteínas y ARN, centrifugar y en la fase acuosa se encuentra el ADN, añadimos etanol para Que precipite por ser insoluble en él, centrifugar y en el precipitado se Encuentra en ADN genómico de gran pureza

. Extracción de proteínas

Centrifugar para separar proteínas solubles de las Unidas a las membranas, después mediante precipitación salina se separan las Proteínas concretas aumentando la fuerza iónica del medio.

Propulsoras:

Flujo del disolvente:
si la sustancia cromatografiada fuera completamente soluble en El disolvente y no actuaran fuerzas de retardo la sustancia ascendería desde el Origen hasta donde llega el diluyente, si la sustancia fuera insoluble en el Disolvente en movimiento no se movería del origen. Solubilidad: en la corriente del disolvente es una fuerza propulsora que tiende a desplazarla manteniéndola en movimiento a lo largo del Papel.

Retardantes:

adsorción: la celulosa de la que está Hecho el papel de filtro puede adsorber, unas sustancias son más adsorbidas que Otras, las sustancias más adsorbidas quedan atrás mientras que las menos Avanzan. Reparto: presencia de dos Fases líquidas individuales, una de ellas es la corriente del disolvente Circulando por el papel de filtro la otra es la fase acuosa contenida en el Papel también, contiene entre un 6 y 12% de agua adherida a la celulosa, cuando Una sustancia que es soluble en dos disolventes no mezclados es expuesta el Mismo tiempo a ambos se reparte entre ellos, la cantidad que se encuentre en Cada disolvente depende de la solubilidad del soluto en cada uno.

C. Intercambio iónico:

se realiza sobre Matrices que tienen una carga neta positiva, la carga de la matriz de la columna y la de las proteínas dependerá del ph del solvente y de su fuerza Iónica, en unas condiciones determinadas son retenidas en la columna las proteínas Que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel, siendo eluídas El resto, para eluir las proteínas retenidas se puede variar la carga iónica Del solvente o el ph alcanzando el punto isoeléctrico de la proteína de interés O el de la matriz, neutralizando la fuerza que retiene a las proteínas en la Columna.

C. Filtración en gel:

Se Usan unas matrices formadas por unas esferas porosas, las moléculas pequeñas Penetran en los pequeños conductos que presentan las bolas de gel donde la Velocidad de flujo de solvente es menor, las moléculas grandes incapaces de Penetrar en los pequeños conductos de las bolas de gel se mueven entre ellas, Donde la velocidad de flujo de solvente es superior, consecuencia las moléculas De mayor peso molecular son eluidas antes que las de menor

. C. De gases:

la separación de los componentes gaseosos se produce Por adsorción selectiva sobre un sólido o por reparto entre un gas inerte y un Liquido no volátil que forma la fase estacionaria, los componentes del gas Problema son sostenidos por un sólido absorbente colocados en una columna Metálica, el gas problema se inyecta en la corriente de un gas inerte que le Conduce hasta la columna y que hace la fase móvil, en la distribución de los Componentes del problema entre el gas portador y el sólido absorbente se Verifica una separación por lo que emergen de la columna a distintos tiempos Pasando al final por un detector que los identifica. En la cgl la fase Estacionaria es un líquido no volátil absorbido en un soporte sólido que Rellena la columna, los componentes del gas problema son desplazados por el gas Portador, los componentes de la muestra se separan de acuerdo con los Coeficientes de reparto entre las dos fases. Instrumentación: la cromatografía Necesita un montaje complejo, sistema cerrado y controlar caudales, presión y Temperatura, fases móviles: H, He, N y aire, fase estacionaria: en cgs carbón Alúmina, silicagel y tamices moleculares, en cgl sólido soporte adsorbente y un Líquido no volátil, detectores: muchos tipos, actúan siempre por comparación de Alguna propiedad física o química del gas portador solo y de la mezcla de gas Portados y componentes problemas.

Descenso Crioscópico:

disminución del punto de congelación de Un disolvente cuando un soluto se encuentra disuelto en él.

Rf:

distancia recorrida por el Compuesto desde el origen entre distancia recorrida por el frente del Disolvente.

Ácido-base según b-l:

un ácido es cualquier especie capaz de donar un protón y base capaz de captarlo.

Volumen muerto de una columna

Cantidad De solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha Reemplazado completamente.

Ascenso Ebulliscópico

Aumento de la tª de ebullición del disolvente líquido cuando Contiene un soluto. Matriz de columna: sustancia empapada de solvente y que se Empaqueta en la columna. Longitud de columna: longitud del dispositivo en el Que se empaqueta la columna, volumen de la columna: volumen total de gel que se Empaqueta en una columna cromatográfica, run throught: volumen de solvente + Proteínas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella.

Mecanismos cromatografía

adsorción: gases o líquidos contenidos En la fase móvil son retenidos por una adsorción selectiva en la superficie del Sólido que constituye una fase estacionaria, Reparto: los componentes de la fase móvil son retenidos por la fase Estacionaria liquida en función de su solubilidad en ella, intercambio iónico: fase estacionaria formada por un sólido Intercambiando iones con iones contenidos en la fase móvil, tamaño molecular: especies neutras de Alto peso molecular pueden ser separadas por su tamaño donde la fase Estacionaria es un gel hidrofílico altamente poroso que retiene las moléculas De menor tamaño al de los poros, Migración eléctrica: los componentes iónicos son separados por su diferente Velocidad y sentido con que se desplazan en un campo eléctrico.

C. En papel:

papel de filtro en uno de Los extremos se deposita una gota de solución que contiene la mezcla de las Sustancias que se quieren separar. Se deja secar la gota y quedará la mancha de Las sustancias, el extremo del papel más próximo a la mancha se introduce en un Disolvente pero sin que la mancha llegue a introducirse en él, ascendente: el disolvente se encuentra En el fondo del recipiente que sostiene al papel y va subiendo a través de el Por capilaridad, descendente: el Disolvente está en un recipiente del que cuelga el papel y va subiendo a través Del el por capilaridad y gravedad, en los dos casos el disolvente avanza por el Papel pasando por encima de la mancha al avanzar se disuelve y arrastra las Sustancias de la mancha cada una de ellas se mueve a distinta velocidad que Otras, se deja actuar el disolvente un tiempo determinado, se seca el papel y Se observan las sustancias separadas si tienen color o en caso de no tenerlo se Revela por una reación química apropiada, esta técnica se conoce como Cromatografía monodimensional.

C. Capa Fina:

Se deposita una capa uniforme muy delgada de una sustancia absorbente En la cromatoplaca, los cromatogramas que se obtienen pueden conservarse y Archivarse si se pulveriza la placa revelada con una dispersión de un plástico Transparente y especial donde quede grabado el cromatograma sobre la película Endurecida del plástico que se separa fácilmente del soporte.

C de columna:

Técnica para el Fraccionamiento de proteínas, consiste en aplicar una muestra compleja de Proteínas a una columna de cristal en la que se sitúa una matriz sólida porosa Que está inmersa en solvente, se bombea una gran cantidad de solvente a través De la columna, las diferentes proteínas se van retrasando de manera distinta según Sus interacciones con la  matriz, las Proteínas se pueden separar de acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamaño o Capacidad de unirse a grupos químicos, la pureza de las fracciones obtenidas se Suele comporbar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida

. C. De afinidad:

las bolas de gel Están recubiertas de un ligando por el que tiene afinidad alguna de las Proteínas a aislar, al pasar la mezcla a través de la columna esta proteína es Retenida en la superficie de las bolas, yéndose el resto, para eluir la Proteína retenida por afinidad se suele aumentar la fuerza iónica de la Solución de solvente o incluir en éste el ligando soluble a alta concentración De forma que compita con el que está unido a las bolas de gel por la uníón de La proteína.

HPLC:

la fase móvil es Un líquido que fluye a través de un sólido por el efecto de la gravedad para Alcanzar alta resolución seria necesario emplear columnas largaz, lo que se Traduciría en un desarrollo muy lentode los cromatogramas, la de alta Resolución trabaja con pequeñas columnas muy empaquetadas y forzando el paso de La fase móvil mediante presiones altas, con lo que se consiguen separaciones Muy efectivas en un plazo muy corto de tiempo, dependiendo de la fase estacionaria El mecanismo de separación puede ser reparto, adsorción, tamaño molecular e Incluso cambio iónico aunque los métodos mas utilizados se basan en el reparto Y adsorción, el esquema fundamental de un cromatógramo de alta resolución está Constituido por un depósito y un dispositivo de bombeo de la fase móvil que Opera a elevada presión, un sistema de inyección de la muestra, columnas Resistentes rellenas de fase estacionaria, detector y un sistema de registro Gráfico. La columna y los detectores van introducidos en termostatos, los Detectores mas utilizados son UV y en medida de índices de refracción.

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