Introducción a la Cromatografía
La cromatografía es un conjunto de técnicas fundamentales para la separación de componentes en mezclas complejas. Inicialmente concebida como una técnica separativa, en la actualidad ha evolucionado para incluir capacidades analíticas al acoplarse a dispositivos que permiten la identificación y cuantificación de las especies separadas.
En los casos donde las muestras son sólidas, se requieren etapas previas de disolución o extracción.
Principio Básico de la Cromatografía
En cromatografía, la separación de solutos se basa en la distinta velocidad de desplazamiento. Esta ocurre cuando los solutos son arrastrados por una fase móvil a través de un lecho cromatográfico que contiene una fase estacionaria.
- La fase estacionaria puede ser sólida o líquida.
- La selección de ambas fases se realiza de manera que los componentes de la muestra se distribuyan de forma diferente entre ellas.
- Los componentes fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil, mientras que aquellos retenidos débilmente avanzan con mayor rapidez.
Clasificación de Técnicas Cromatográficas
- Cromatografía en Columna: La fase estacionaria se introduce en un tubo estrecho a través del cual fluye la fase móvil (líquida, gaseosa o fluido supercrítico).
- Cromatografía Plana: La fase estacionaria se deposita sobre un soporte plano, y la fase móvil es siempre un líquido.
Términos Clave en Cromatografía
- Elución: Transporte de una sustancia a través de la fase estacionaria impulsada por la fase móvil.
- Eluyente: La fase móvil.
- Cromatograma: Gráfico que representa la respuesta del detector a lo largo del tiempo de análisis.
- Detector: Equipo que detecta cambios de composición en la fase móvil.
- Tiempo de Retención (tR): Tiempo transcurrido desde la inyección de la muestra hasta el pico máximo de señal de un constituyente en el detector.
- Tiempo Muerto: Tiempo que tarda un compuesto no retenido o la fase móvil en llegar al detector.
Factores que Influyen en la Separación
Los coeficientes de reparto o distribución elevados favorecen una buena separación entre componentes, pero incrementan el tiempo de elución, lo que puede causar un ensanchamiento de la banda del componente.
Regímenes Cromatográficos
- Régimen Isocrático: Las condiciones cromatográficas (temperatura, concentración y flujo de la fase móvil) permanecen constantes durante toda la separación.
- Régimen en Gradiente: Las características de la elución se modifican durante la separación mediante cambios en la temperatura, composición o flujo de la fase móvil.
Análisis Cualitativo y Cuantitativo
- Análisis Cualitativo: Busca identificar los componentes de una mezcla. Se utilizan parámetros como el tiempo de retención (tR) o el espectro.
- Análisis Cuantitativo: Determina la cantidad de cada componente en la mezcla. Se basa en la comparación del área o altura del pico con patrones de concentraciones conocidas.
Los parámetros cromatográficos para el análisis cualitativo son el tiempo de retención (tR) y el volumen de retención (vR). Es preferible utilizar valores relativos en lugar de absolutos para mejorar la reproducibilidad.
Cuantificación por Patrón
- Patrón Interno: Se añade una cantidad conocida de una sustancia externa a la muestra y a las soluciones estándar. Se comparan las áreas de los picos de los componentes de la muestra con el área del patrón interno.
- Patrón Externo: Se elabora una curva de calibrado con áreas de picos de soluciones estándar de distintas concentraciones. La concentración de los analitos se calcula por interpolación.
Tipos de Cromatografía
Cromatografía en Papel
La fase estacionaria es el papel. La muestra se deposita con un capilar. La fase móvil líquida asciende por capilaridad, arrastrando y separando los componentes. Tras la elución y secado, se revelan las manchas con reactivos para visualizarlas.
Cromatografía en Capa Fina (TLC)
Similar a la cromatografía en papel, pero la fase estacionaria es gel de sílice, alúmina u otros materiales sobre un soporte plano. La retención se produce por fuerzas de Van der Waals o puentes de hidrógeno. Sirve para análisis cualitativo o semicuantitativo, con identificación por tR y color, a veces con ayuda de lámparas UV.
Cromatografía en Columna
Utiliza columnas rellenas de fase estacionaria sólida (alúmina, sílice). La muestra líquida se introduce en la parte superior y la fase móvil fluye lentamente. Los componentes se separan y eluyen en fracciones distintas. Es útil para separar compuestos, pero para cuantificación se recurre a CG o HPLC.
Cromatografía de Intercambio Iónico
Las partículas cargadas se unen a una matriz con carga opuesta. La elución de partículas cargadas negativamente se logra modificando el pH del solvente.
Cromatografía de Exclusión Molecular (Filtración sobre Gel)
Las moléculas pequeñas penetran en los poros del gel, moviéndose más lentamente. Las moléculas grandes, al no penetrar, se mueven más rápido entre las partículas, eluyendo antes.
Cromatografía de Afinidad
Las bolas de gel están recubiertas con un ligando que tiene afinidad por una proteína específica. Esta proteína es retenida, mientras que las demás eluyen. La elución se logra aumentando la fuerza iónica de la solución.
Cromatografía de Gases (CG)
La muestra se inyecta y volatiliza en la columna. La fase móvil es un gas inerte. La fase estacionaria puede ser sólida (adsorción) o líquida (partición/reparto).
Suministro de Fase Móvil en CG
Los gases más comunes son Helio, Argón, Nitrógeno, Dióxido de carbono e Hidrógeno. Es crucial controlar el caudal y la ausencia de fugas.
Sistema de Inyección de Muestra en CG
Dispositivo con septum para inyectar la muestra. La temperatura de la cámara de vaporización debe ser superior a la del componente menos volátil. La inyección puede ser manual (microjeringas) o automática. Los inyectores pueden tener un sistema split (división del flujo) o splitless (para bajas concentraciones).
Casos Especiales de Inyección
- Espacio de Cabeza Estático: Análisis de la fase de vapor en equilibrio con la muestra en un sistema cerrado.
- Espacio de Cabeza Dinámico: Renovación continua del gas para desplazar volátiles a una trampa, donde se concentran y luego se arrastran al cromatógrafo.
Columna Cromatográfica en CG
Existen columnas empaquetadas (en desuso) y capilares (más estrechas, largas, con mejor resolución y sensibilidad). La elección de la fase estacionaria (polar o apolar) depende de la polaridad de los compuestos a separar.
Horno Termostatizado
La temperatura de la columna es crucial para la separación. Un aumento de temperatura acelera la elución, pero debe equilibrarse con la resolución necesaria.
Detectores en CG
Detectan los solutos que salen de la columna. Deben tener buena sensibilidad, estabilidad, respuesta lineal y tiempo de respuesta corto.
- Detector FID (Ionización de Llama): Detecta compuestos orgánicos por combustión en una llama aire-hidrógeno. Es casi universal, no detecta gases no combustibles.
- Detector TCD (Conductividad Térmica): Responde a cualquier soluto con conductividad térmica diferente al gas portador. Es no destructivo.
- Detector de Captura de Electrones: Detecta especies electronegativas que capturan electrones. Muy sensible a moléculas con halógenos.
- Detector de Masas (MS): Ioniza la muestra, separa los iones por su relación m/q y genera un espectro de masas.
Sistema de Registro y Tratamiento de Señal
Equipos para amplificar, registrar y procesar los datos cromatográficos.
Aplicaciones de la CG
Determinación de compuestos orgánicos en alimentos, muestras biológicas, aguas, contaminantes atmosféricos, análisis de grasas, etc.
Cromatografía de Líquidos de Alta Eficacia (HPLC)
La fase móvil es un líquido impulsado a alta presión. La fase estacionaria se encuentra en una columna de acero inoxidable. La fase móvil circula por el equipo.
Suministro de Fase Móvil en HPLC
El sistema de bombeo de alta presión es esencial. El caudal debe ser controlado para asegurar la reproducibilidad. La elección de la fase móvil depende de los analitos y la columna. Se puede trabajar en régimen isocrático o en gradiente. Los disolventes deben ser desgasificados.
Sistema de Inyección de Muestra en HPLC
Se utilizan válvulas rotatorias de alta presión para inyectar volúmenes precisos de muestra en la entrada de la columna, minimizando la perturbación del flujo.
Columna Cromatográfica en HPLC
Columnas de acero inoxidable con partículas de sílice, alúmina o cambiadores iónicos como fase estacionaria. Se usan precolumnas para proteger la columna principal. Se recomienda mantener la temperatura constante.
Detectores en HPLC
Detectan los solutos saliendo de la columna. Deben tener buena sensibilidad, estabilidad, respuesta lineal y bajo ruido.
- Detector Espectrofotométrico (UV/VIS): Mide la absorbancia a una o varias longitudes de onda.
- Detector de Fluorescencia: Mide la emisión fluorescente de los analitos. Puede requerir derivatización.
- Detector Electroquímico: Detecta compuestos electroactivos (oxidación/reducción) o mide conductividad eléctrica.
- Detector Refractométrico: Mide cambios en el índice de refracción de la fase móvil. Es universal pero menos sensible y afectado por la temperatura.
Sistema de Registro y Tratamiento de Señal
Equipos para amplificar, registrar y procesar los datos cromatográficos.
Aplicaciones de la HPLC
Determinación de aminoácidos, proteínas, carbohidratos, hidrocarburos, ácidos nucleicos, drogas, hormonas, pigmentos, etc. Es ideal para especies no volátiles o termolábiles.
Cromatografía de Fluidos Supercríticos (SFC)
Híbrido entre CG y CL, permite separar y cuantificar sustancias no volátiles, térmicamente inestables o sin grupos funcionales para CL. Los fluidos supercríticos actúan como fase móvil, con propiedades intermedias entre gas y líquido. Se utilizan columnas capilares y detectores como FID, masas o UV.