Protocolos Esenciales de Laboratorio para el Cultivo e Identificación de Hongos y Microorganismos

Micología: Cultivo e Identificación de Hongos

Medios de Cultivo para Hongos

• Agar Sabouraud (A. Sabouraud)
• Agar PDA (Potato Dextrose Agar)
• Agar Rosa de Bengala
• Agar Czapek
• Agar Extracto de Malta

Estudio Macroscópico

• Forma y tamaño de la colonia
• Color de la superficie
• Difusión del pigmento
• Textura
• Consistencia
• Rapidez de crecimiento

Estudio Microscópico

• Tipos de hifa
• Tipo de micelio (hialino, transparente, o dematiáceo, oscuro)
• Tipo de esporas

Técnicas de Estudio Micológico

Técnica de la Cinta Adhesiva Transparente (Rush-Munro)

1. Apoyar el lado engomado de un trozo de cinta adhesiva transparente sobre la superficie de una colonia.
2. Colocar la cinta bien extendida sobre una gota de azul de lactofenol o azul de anilina, colocada a su vez sobre un portaobjetos.

Desventaja: Si la cinta transparente no se presiona con suficiente firmeza sobre la superficie de la colonia, la muestra no es adecuada, ya que al no quedar bien adherida, las esporas o las hifas no se pueden identificar correctamente.

Técnica de Montaje Húmedo (Lámina y Laminilla)

1. Tomar el material a observar en una mínima cantidad con agujas finas o lancetas, procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de los portaobjetos. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede amontonado.
2. Colocar el cubreobjetos poco a poco, empezando por un lado para evitar que se formen burbujas entre el portaobjetos y el cubreobjetos.

Técnica del Microcultivo (Cultivo en Lámina)

1. En la superficie de una caja de Petri se coloca un pedazo de papel de filtro o un trozo de algodón y dos varillas de vidrio, cortadas a un tamaño adecuado. Se coloca un portaobjetos y un cubreobjetos sobre las varillas y se esteriliza.
2. Se corta un pequeño bloque de agar (Sabouraud, PDA, etc.) previamente vertido en una caja de Petri hasta una profundidad de 4 mm. Esto puede hacerse usando una hoja de bisturí estéril o un tubo de ensayo recto estéril sin bordes. Con el mismo bisturí estéril se coloca el bloque de agar sobre la superficie del portaobjetos (También puede agregarse al portaobjetos con una pipeta estéril una o dos gotas del agar).
3. Con un asa de aguja estéril se remueven porciones pequeñas de la colonia de hongos que se desea estudiar y se inocula en los cuatro cuadrantes del bloque de agar.
4. Luego de la inoculación, se coloca un cubreobjetos estéril sobre la superficie del agar.
5. Se controla que el papel o el trozo de algodón estén húmedos y se incuba.

Preparación de Medios de Cultivo

1. Pesar cuidadosamente los ingredientes de acuerdo con la formulación (en caso de medios deshidratados, pesar según lo indicado por el fabricante).
2. Agregar agua destilada o rehidratar.
3. Homogeneizar los ingredientes, llevándolos a calor.
4. Enfriar y medir el pH.
5. Colocar en matraces, tubos, etc.
6. Llevar a esterilizar en autoclave a 121 ºC por 15 minutos.
7. Repartir en placas o tubos.

Clases de Siembra Microbiológica

Siembra por Aislamiento

Se realiza con la finalidad de separar especies microbianas para obtener un cultivo puro a partir de una muestra problema (orina, heces, agua, alimentos, secreciones). Estas pueden ser:

Métodos de Siembra por Aislamiento

• Siembra por agotamiento en superficie: Consiste en diseminar los microorganismos en la superficie del medio en placas de Petri y pueden ser:
  • Siembra por agotamiento y estría.
  • Siembra por agotamiento en superficie con espátula de Drigalsky.
• Siembra por diluciones sucesivas: Consiste en hacer diluciones de una muestra y luego colocar 1 ml de cada dilución en placas de Petri. Posteriormente, se vierte el medio licuado y mantenido a 45 ºC, y se homogeniza la placa (placa vertida o por incorporación).

Siembra por Trasplante

La finalidad es hacer perdurar el microorganismo, transfiriéndolo periódicamente de un cultivo a un nuevo medio de cultivo, o bien para realizar la identificación bioquímica. El trasplante puede ser:

• De líquido a sólido
• De líquido a líquido
• De sólido a sólido
• De sólido a líquido

Siembra de Acuerdo con el Estado Físico del Medio de Cultivo

• Siembra por estría en tubos en agar inclinado (Sólido)
• Siembra por puntura o picadura (Semisólido)
• Siembra por inoculación o agitación (Líquido)

Metabolismo de Carbohidratos y Pruebas Bioquímicas

Utilización de la Glucosa

La glucosa constituye para los microorganismos la principal fuente de carbono. Su degradación se produce por tres vías principales:

• Vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)
• Vía de Entner-Doudoroff (ED)
• Vía de Warburg-Dickens (Hexosa Monofosfato o HMP)

Medio: Caldo Clark Lubs

• Peptona
• Glucosa
• K₂HPO₄
• Agua destilada

Prueba de Rojo de Metilo (RM) – Fermentación Mixta

En esta prueba se emplea el indicador rojo de metilo, mediante el cual se puede determinar la concentración de hidrogeniones que se produce cuando una bacteria metaboliza la glucosa, indicando la producción de ácidos estables.

Lectura

• RM Positivo (+): Después de adicionar el indicador, el medio de cultivo deberá permanecer de un color rojo en la superficie.
• RM Negativo (-): Color amarillo en la superficie del medio.

Prueba de Voges-Proskauer (VP)

Detecta la presencia de acetilmetilcarbinol (acetoína) entre los productos finales de la fermentación de la glucosa. Al quedar en presencia del álcali (KOH al 40%), el acetilmetilcarbinol se oxida a diacetilo, que a su vez reacciona con el núcleo de la guanidina presente en la peptona, dando color rosado o rojo.

Lectura

• VP Positivo (+): Después de adicionar los reactivos, el medio de cultivo deberá aparecer de un color rojo en la superficie (después de 15 minutos).
• VP Negativo (-): Color amarillo cobrizo en la superficie del medio.

Fermentación de la Lactosa

Los microorganismos pueden fermentar la lactosa en condiciones aerobias o anaerobias, debido a que presentan dos enzimas: una permeasa que permite la entrada de la enzima β-galactosidasa a la célula bacteriana para poder desdoblar la lactosa en glucosa y galactosa. Estos monosacáridos siguen su degradación formando acidez.

Medio: Caldo Lactosado Rojo de Fenol

• Peptona proteosa
• Extracto de carne
• Lactosa
• Cloruro sódico
• Rojo de fenol (indicador)

Lectura

• LACTOSA Positiva (+): Se manifiesta por un cambio de color del indicador en el medio de cultivo de rojo a amarillo.
• LACTOSA Negativa (-): Si no se presenta cambio de color en el medio.
• GAS Positivo (+): Se presenta por la presencia de una burbuja en la campana de Durham por la acumulación de gas.
• GAS Negativo (-): No hay presencia de burbujas.

Hidrólisis del Almidón / Producción de Amilasa

Ciertos microorganismos producen una exoenzima, la amilasa, capaz de hidrolizar el almidón, causando su degradación en maltosa y glucosa. Esta degradación resulta en la pérdida de la capacidad de dar una reacción de color con la solución de Lugol, lo que permite su identificación.

Medio: Agar Almidón

• Extracto de carne
• Almidón soluble
• Agar-Agar

Lectura (Tras adición de Lugol)

• AMILASA Positiva (+): Si alrededor de la colonia se observan zonas o halos claros, lo que indica que el almidón se ha hidrolizado por la presencia de la enzima.
• AMILASA Negativa (-): Si no se observan zonas o halos claros alrededor de la colonia.