Introducción a la Siembra Microbiana
Una vez preparados los medios de cultivo, se procede a la siembra. La siembra es la operación de colocar un microorganismo asépticamente en un medio de cultivo; es decir, es el acto de depositar un inóculo en dicho medio. Se define inóculo como una cantidad de microorganismos procedentes de un material contaminado o infeccioso.
Una vez realizada la siembra, se procede a incubar el medio a una temperatura adecuada. Si el medio donde crece el microorganismo es líquido, el crecimiento se indica por la turbidez del medio; si es sólido, se formarán colonias. Las colonias no son más que masas aisladas formadas por un conglomerado de millones de microorganismos de una misma especie, las cuales se pueden apreciar a simple vista y se desarrollan a partir de una sola célula, presentando características propias para cada especie (ver lámina anexa sobre los tipos de colonias).
Si «picamos» una sola colonia y la sembramos en un nuevo medio de cultivo, estamos realizando una resiembra o subcultivo, método muy útil en la obtención de cultivos puros que estudiaremos en la segunda parte de esta práctica de laboratorio.
Formas Comunes de Siembra
Las siembras pueden realizarse de diferentes formas:
- Por punción en el medio sólido (con aguja).
- Por estría en medio sólido (con asa).
- Por punción y estría en medio sólido (con aguja).
- Por suspensión en medio líquido (con asa o pipeta).
- Por frotación o dispersión (con espátula de Drigalski o rastrillo).
- Por placa vertida.
Desarrollo Práctico de Siembra
- Siembra en Agar Nutritivo: Realice la siembra del tubo 1 a una placa de Agar Nutritivo. Utilice tórula (hisopo) estéril para colocar el inóculo y realice estrías con asa estéril. Rotule la placa y, una vez lista, colóquela en la incubadora invertida (incubación a 35ºC – 37ºC por 24 a 48 horas). Después de este tiempo, debe pasar por el laboratorio para realizar las lecturas y dibujar en la guía lo observado.
- Siembra en Agar McConkey: Realice la siembra de los tubos 2 y 3. Divida por el reverso en dos la placa de Agar McConkey; en una parte sembrará una estría corrida de la muestra del tubo 2 y en la otra, del tubo 3. Recuerde esterilizar el asa antes y después de cada siembra y enfriarla antes de tomar el inóculo. Puede enfriarla en los bordes del propio medio o en el reverso interno de la tapa de la placa de Petri. Siga posteriormente los mismos pasos que en el experimento anterior.
- Siembra por Dispersión en Agar Sabouraud: Agregue una gota con pipeta Pasteur estéril de la muestra del tubo 3 en el centro de una placa que contiene Agar Sabouraud. Realice siembra por dispersión con espátula de Drigalski (esterilice el rastrillo antes de usarlo, introduciéndolo en alcohol y pasándolo por la llama del mechero; posteriormente, enfríelo por el reverso de la tapa de la placa). Trate de esparcir la muestra en toda la superficie del medio. Rotule y siga los mismos pasos que en los experimentos anteriores.
- Resiembra de Cultivo Mixto en Agar Levine: Pique una colonia de un cultivo mixto con asa y siembre el inóculo en una placa de Petri con Agar Levine. Realice las estrías y siga los mismos pasos que en los experimentos anteriores.
- Siembra en Agar SS: Realice una siembra por estría con asa del tubo 4 en una placa con Agar SS. Trabaje con extremas medidas de asepsia y desinfección, ya que está trabajando con microorganismos muy patógenos. Siga los mismos pasos.
- Clasificación de Medios de Cultivo: Consulte el Manual de Medios de Cultivo Merck y clasifique cada uno de los medios de cultivo que ha utilizado en esta práctica, indicando para qué microorganismos se utilizan.
Segunda Parte: Técnicas de Aislamiento
Las técnicas de aislamiento son utilizadas para obtener cultivos puros. Recuerde que los cultivos puros son aquellos que se obtienen a partir de una sola célula y, por lo tanto, toda la descendencia será del mismo tipo celular y libre de otras formas microbianas, mientras que los cultivos mixtos provienen de muestras que poseen gran variedad de microorganismos; por ejemplo, muestras de tierra, contaminaciones fecales, etc.
Técnicas para Obtener Cultivos Puros
Técnica de Siembra por Estrías en Placa
Esta es una técnica de rutina en el trabajo diario de microbiología. Consiste en sembrar una muestra sobre una superficie de un medio de cultivo sólido en placa de Petri. La siembra por estría se realiza con asa y se efectúa con una sola asada, realizando pases en tres cuadrantes de la placa, rotándola con la mano izquierda.
Técnica por Difusión en Placa
Consiste en la localización de una muestra líquida con pipeta estéril en el centro de la superficie de un medio sólido en placa, distribuyéndola en todos los sentidos con espátula de Drigalski. En ambos casos, el objetivo es obtener colonias por separado para posterior resiembra y obtener cultivos puros.
Técnica de Placa Vertida
Para esta técnica se utilizan los medios a 45ºC (todavía en estado líquido) y se les agrega una proporción de suspensión de bacterias, agitando el mismo para unificar la muestra. Se saca una asada a otro tubo de medio de cultivo estéril, se agita, y de este se saca una asada a otro tubo de medio de cultivo igualmente estéril. Esto se puede realizar con ‘n’ tubos, los cuales se vierten en placas de Petri estériles, se incuban, y al cabo de este tiempo se observará el crecimiento de colonias de las cuales se pueden realizar resiembras para obtener cultivos puros.
Técnica de Enriquecimiento del Cultivo
Para esta técnica se utilizan medios de enriquecimiento. Esta técnica se usa generalmente cuando el tipo de microorganismo que queremos aislar se encuentra en muy pequeñas cantidades y se desarrolla con mayor lentitud que muchas otras especies presentes en el medio. Por ejemplo, el medio Selenito para el desarrollo de Salmonella y Shigella.
Técnica de Aislamiento de una Sola Célula
Para esta técnica especial se utiliza un equipo llamado micromanipulador que se adapta a un microscopio óptico. Se extrae una sola célula bacteriana y se pasa a un medio de cultivo adecuado. Es una técnica que solo se utiliza en investigaciones muy exactas y requiere un operador experimentado.
Técnica de las Diluciones en Serie
Esta será la técnica que desarrollaremos en esta etapa práctica. Se utiliza cuando el microorganismo que se quiere aislar en cultivo puro se encuentra en uno mixto pero en mayor cantidad que los demás. Es posible, mediante diluciones seriadas en tubos, diluir las muestras y facilitar su aislamiento. Es muy útil para cuantificar una población bacteriana.
Funcionalidad de los Medios de Cultivo
Medios de Enriquecimiento
Son aquellos medios que favorecen las exigencias nutricionales de algunos microorganismos. Ejemplo: Agar Sangre, Agar Chocolate, etc.
Medios Selectivos
Medios que favorecen el desarrollo de determinados microorganismos, ya que contienen sustancias inhibidoras para otros. Ejemplo: Agar SS, Agar Endo, etc.
Medios Diferenciales
Medios generalmente sólidos que imparten alguna característica distintiva a las colonias de algunos microorganismos, lo que permite identificarlos fácilmente. Ejemplo: Agar McConkey, Agar Levine, etc.