El Ensayo de Esterilidad
El ensayo de esterilidad se realiza con la finalidad de determinar la ausencia de microorganismos (MO) tanto en los lugares de fabricación como en los medicamentos.
Propósitos Implícitos del Control
- Determinar el número de MO presentes.
- Lograr la inhibición del MO.
- Determinar la presencia de conservantes.
Objetivos del Control Microbiológico
- Reconocer la importancia del control higiénico de medicamentos.
- Interpretar los criterios microbiológicos utilizados.
- Verificar si el medicamento analizado se ajusta a la normativa vigente.
- Realizar el control de esterilidad del medicamento, control general, inactivación del conservante y pruebas definitivas.
- Poner en práctica diferentes técnicas microbiológicas: vertido en placa, inoculación de microorganismos de prueba, etc.
Método de Kirby-Bauer (Difusión en Disco)
En el método de Kirby-Bauer, el microorganismo (MO) es inoculado en la superficie de una placa de agar, sobre la cual se colocan discos impregnados con una concentración conocida del antibiótico (ATB).
Procedimiento y Resultados
- Las placas se incuban por 16-18 horas a 35-37° C.
- Durante la incubación, el antibiótico difunde radialmente desde el disco a través del agar, por lo que su concentración disminuye a medida que se aleja del disco.
- El diámetro del área de inhibición alrededor del disco se convierte en categorías: Sensible (S), Intermedio (I) o Resistente (R), de acuerdo con tablas normativas.
Consideraciones Clínicas y Aplicación
Dado que las pruebas de sensibilidad in vitro dan solamente una idea aproximada de la acción inhibitoria, es necesario tener presente que la verdadera respuesta es la respuesta clínica del paciente luego de administrada la dosis adecuada.
Las pruebas de sensibilidad se indican para cualquier MO causante de un proceso infeccioso que necesite tratamiento antimicrobiano y cuya sensibilidad no pueda ser predecida. El antibiograma debe realizarse con cepa pura, utilizando varias colonias de aspecto semejante del germen a probar.
Microorganismos con Sensibilidad Variable
Estafilococos, Enterobacterias, Pseudomonas, Enterococos y algunos bacilos Gram negativos (-) no fermentadores de glucosa.
Clasificación de Microorganismos según Requerimiento de Oxígeno (O₂)
- Aerobios estrictos: Requieren presencia de O₂ para su desarrollo (ejemplo: Pseudomonas).
- Anaerobios estrictos: Requieren la ausencia de O₂ para su desarrollo (ejemplo: Salmonella).
- Anaerobios facultativos: Son aquellos que pueden desarrollarse aun en la presencia de O₂ (ejemplo: Staphylococcus aureus).
- Microaerófilos: Son aquellos que requieren bajas concentraciones de O₂ (ejemplo: Streptococcus). Se cultivan típicamente en la lata con vela.
Cultivos para Anaerobios
Los medios utilizados incluyen agar sangre (sólido) y tioglicolato (líquido). Deben ser enriquecidos porque los anaerobios no utilizan el oxígeno como fuente de energía.
Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)
La CIM determina la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo.
Diferencias entre CIM y Kirby-Bauer
| Método | Principio | Ventaja | Desventaja |
|---|---|---|---|
| CIM | Dilución | Se obtiene la mínima concentración con la que se inhibe el crecimiento. | Costoso, complejo y requiere más tiempo. |
| Kirby-Bauer (K.B.) | Difusión | Rápido y sencillo. | Solo indica si es sensible o resistente a la concentración del disco de ATB. |
Criterios Microbiológicos para Productos Farmacéuticos (Límites)
Estos límites definen la calidad microbiológica aceptable según la vía de administración del producto.
Categoría 1 (CAT 1)
CAT 1.1: Aplicación en Piel Comprometida
Productos para ser aplicados sobre escaras, ulceraciones o quemaduras graves.
- Requisito: Ausencia de gérmenes revivificables.
CAT 1.2: Vía Inhalatoria
Productos para ser administrados por vía inhalatoria.
- Recuento de aerobios viables totales: No más de 10 UFC/g o ml.
- Ausencia de Enterobacteriaceae en 1 g o ml.
- Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 1 g o ml.
- Ausencia de Staphylococcus aureus en 1 g o ml.
Categoría 2 (CAT 2)
Productos para ser administrados por vía nasal, ótica, rectal, tópica y vaginal.
- Recuento de aerobios viables totales: No más de 10² UFC/g o ml.
- Ausencia de Enterobacteriaceae en 1 g o ml.
- Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 1 g o ml.
- Ausencia de Staphylococcus aureus en 1 g o ml.
Categoría 3 (CAT 3)
Productos para ser administrados por vía oral.
- Recuento de aerobios viables totales: No más de 10³ UFC/g o ml.
- Recuento de hongos y levaduras: No más de 10² UFC/g o ml.
- Recuento de Enterobacteriaceae: No más de 10² UFC/g o ml.
- Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (solamente en forma farmacéutica oral líquida) en 1 ml.
- Ausencia de Staphylococcus aureus en 1 g o ml.
- Ausencia de Escherichia coli en 1 g o ml.
- Ausencia de Salmonella en 1 g o ml.
Materias Primas Contaminantes
Productos farmacéuticos cuyas materias primas se consideren fuentes de contaminación:
- Ausencia de anaerobios sulfitoreductores en 1 g o ml.
Preparación de Placas para Kirby-Bauer
Medio de Cultivo: Agar Mueller-Hinton
Se utiliza exclusivamente el Agar de Mueller-Hinton, con un pH de 7,2 a 7,4. Este agar es el más indicado porque:
- Presenta buena reproducibilidad de resultados lote a lote.
- Es pobre en contenido de timina (la timina compite con sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclinas, lo que podría generar falsas resistencias).
- Brinda buen crecimiento a muchos patógenos.
- Existe una gran cantidad de datos estandarizados sobre pruebas de sensibilidad con este medio.
Procedimiento de Vertido y Almacenamiento
- Deben verterse de 25 a 30 ml de agar fundido por placa para obtener una altura uniforme de 4 mm. Esta altura es crítica para no obtener halos excesivamente reducidos o ampliados.
- Las placas preparadas y envueltas pueden conservarse de 4 a 7 días en refrigeración (heladera).
- Para evitar las gotas de condensación, las placas deben secarse de 15 a 30 minutos invertidas en estufa a 37ºC antes de la siembra.
Preparación del Inóculo y Siembra
Se toman de 3 a 10 colonias bien aisladas con un asa y se introducen en 5 ml de caldo de tripticasa soya. El objetivo es alcanzar la turbidez del testigo, equivalente a 0,5 de la escala McFarland.
Pasos de la Siembra (Antibiograma)
- Tomar la colonia pura de una caja de Petri.
- Diluir hasta alcanzar la turbidez de 0,5 en la escala McFarland.
- Tomar un hisopo y escurrir el exceso de líquido en la pared del tubo.
- Realizar el hisopado 3 veces, girando la placa 60º en cada pasada.
- Agregar los monodiscos de antibiótico (ATB).
Causas Comunes de Error
Las principales causas de error incluyen:
- No conseguir la turbidez estandarizada.
- No trabajar bajo los conceptos de esterilidad.
- Agregar una altura incorrecta de agar (más o menos de los 4 mm).
Medio de Tioglicolato
El medio de tioglicolato se utiliza para el cultivo de microorganismos anaerobios. Sus componentes clave son:
- Resazurina: Indicador que cambia a rosa en presencia de oxígeno (O₂).
- Glucosa: Fuente de energía.
- Pequeña cantidad de agar: Ayuda a evitar la difusión de CO₂ y O₂.
Se agrega vaselina para ayudar a mantener el ambiente anaeróbico.