Fundamentos Esenciales de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

1. ¿Qué es la Técnica PCR?

Es una técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde.

2. Aplicaciones y Logros de la Técnica PCR

• Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción (PCR múltiple).
• Amplificar fragmentos de ARN (RT-PCR).
• Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presente en una muestra.

3. Ventajas de la PCR frente a Otras Técnicas

• Como técnica de amplificación, supone un considerable ahorro de tiempo y, además, está completamente automatizada.
• Como técnica de detección, requiere una cantidad de muestra muchísimo menor (respecto a la hibridación) y permite la cuantificación de secuencias concretas.

4. Ventajas y Desafíos de la PCR

Su principal ventaja es su gran sensibilidad, que es también la causa de su principal problema: la contaminación por aerosoles, microorganismos o células de descamación.

5. Aplicaciones Inmediatas de la PCR

• El diagnóstico y pronóstico de ciertas enfermedades.
• La evolución y respuesta a tratamientos.
• Los estudios de expresión génica.
• Mutagénesis.
• Estudios filogenéticos.
• Genotipado.
• Medicina forense, entre otras.

6. Cebadores en PCR: Definición y Tipos

Son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria de las regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar.

Hay dos tipos:

• El cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3´-5´ (cebador forward).
• El que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5´-3´ (cebador reverse).

7. Función de los Cebadores en la PCR

Define y delimita la región diana de una molécula de ADN que se amplificará y que será la comprendida entre ambos.

8. Diseño de Cebadores: Longitud y Contenido G-C Óptimos

• La longitud idónea está comprendida entre 18 y 30 bases.
• La proporción idónea está comprendida entre un 40% y un 60% de contenido de G-C.

9. Elementos a Evitar en la Secuencia de los Cebadores

Los cebadores no deben contener secuencias complementarias intra- e intermoleculares.

10. Definición de ADN Polimerasas Termoestables

Son enzimas aisladas de un grupo especial de arqueobacterias extremófilas (termófilas) con actividad polimerasa a temperaturas elevadas.

11. Tipos de ADN Polimerasas Termoestables

• Actividad exonucleasa 5´-3´, pero sin actividad exonucleasa 3´-5´.
• Actividad exonucleasa 5´-3´ y actividad exonucleasa 3´-5´.
• Actividad transcriptasa inversa.

12. Fases de un Ciclo Básico de PCR

• Desnaturalización del ADN molde.
• Hibridación de los cebadores con el ADN molde.
• Extensión de los cebadores.

13. Productos de Amplificación en los Ciclos Iniciales de PCR

• Productos del primer ciclo: 2 productos no deseados (2×1) y 0 productos deseados.
• Productos del segundo ciclo: 4 productos no deseados (2×2) y 0 productos deseados.
• Productos del tercer ciclo: 6 productos no deseados (2×3) y 2 amplicones.

14. PCR Estándar o Convencional: Definición

Es la forma más simple de PCR, en la que se amplifica un único fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso de amplificación a tiempo final.

15. La Mezcla de Reacción en PCR: Componentes Esenciales

Es la mezcla que contiene todos los reactivos necesarios que deben estar presentes en el medio de reacción para que la PCR se desencadene de forma adecuada.

16. Función del Cloruro Magnésico (MgCl₂) en la PCR

• Concentración baja: Determina la inactividad de la ADN polimerasa.
• Concentración alta: Determina una menor fidelidad en la replicación.

17. Requisitos de Calidad del ADN Molde para PCR

• Alto grado de integridad: ADN de alto peso molecular, no degradado ni fragmentado y sin mellas.
• Cociente A₂₆₀/A₂₈₀ entre 1,7 y 2, que garantiza que no está contaminado con proteínas.
• Libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR (inactivación de la ADN polimerasa, secuestro del Mg²⁺ libre).

18. ¿Qué es la Mezcla Maestra (Master Mix) en PCR?

Es la mezcla de todos los componentes necesarios para la realización de la PCR: cloruro magnésico, dNTPs (desoxirribonucleótidos trifosfato), cebadores y la ADN polimerasa (lo único que no se añade es el ADN molde).

19. Controles en PCR: Positivo y Negativo (Blanco)

• Control Positivo (+): Tubo con mezcla maestra al que se añade ADN molde control que contiene el fragmento que se quiere amplificar.
• Control Negativo (-) o Blanco: Tubo con mezcla maestra en el que se sustituye el ADN molde por un volumen igual de agua de grado PCR, de manera que no habrá ADN presente en la reacción.

20. El Termociclador: Función y Capacidades

Es el aparato en el que se lleva a cabo la reacción de la PCR.

Permite programar los ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos de incubación para que se desarrollen de forma automatizada.

21. Programación de un Termociclador para PCR

Desnaturalización Inicial

Etapa que inicia la reacción de PCR. Consiste en calentar la mezcla de reacción a 94-95ºC durante varios minutos.

Ciclos de Replicación

• Programación de las temperaturas y los tiempos de incubación de cada una de las fases del ciclo básico de PCR.
• Número de veces que se va a repetir el ciclo.

Extensión Final

Etapa que finaliza la PCR, consistente en una incubación a la temperatura óptima de la ADN polimerasa.

Mantenimiento

Se realiza una incubación a 4°C sin límite de tiempo.

Variantes Avanzadas de PCR

Existen diversas variantes de PCR, como la PCR de grandes fragmentos, de alta fidelidad, anidada y de inicio en caliente (hot start).

31. PCR en Tiempo Real (qPCR): Definición, Monitorización y Ventajas

En la PCR en tiempo real (qPCR) se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de productos fluorescentes, de manera que la detección de los amplicones se realiza ciclo a ciclo.

Ventajas de la qPCR

• Mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en una muestra.
• Resultados más fidedignos.
• Minimiza los problemas de contaminación.
• Permite la cuantificación tanto de amplicones producidos como del ADN diana inicial presente en la muestra.

Se realiza en un termociclador en tiempo real, el cual incorpora un lector (detector) de fluorescencia, de manera que puede medir la intensidad de fluorescencia en cada tubo en cualquier momento de la PCR (gracias a la monitorización).