Fundamentos y Protocolos Esenciales en el Laboratorio de Microbiología Clínica

El Laboratorio de Microbiología: Objetivos y Asepsia

El laboratorio de microbiología investiga la etiología de las enfermedades infecciosas, aquellas causadas por microorganismos patógenos como bacterias, virus, parásitos y hongos. Su objetivo principal es la identificación del agente patógeno presente en las muestras clínicas. Es importante mantener condiciones de asepsia, evitando la contaminación de las muestras.

Definición de Asepsia

Asepsia: Técnica de saneamiento destinada a eliminar microorganismos patógenos de personas, animales, superficies, ambientes o cosas.

Procedimientos para Trabajar Asépticamente

• Mantener el local, superficies y equipos limpios.
• Usar instrumental, recipientes, medios y reactivos esterilizados.
• Seguir procedimientos asépticos durante todas las operaciones.

Equipamiento y Seguridad Biológica

El equipamiento incluye cabinas de seguridad biológica o zonas con mechero Bunsen, que crea un campo estéril de unos 30 cm de diámetro.

Uso del Mechero Bunsen

Preparación del Área

1. Descontaminar la superficie con etanol.
2. Encender el mechero y ajustar la llama azul.
3. Colocar solo el material necesario dentro del campo estéril.

Medidas de Seguridad

• Recoger el pelo y evitar ropa holgada.
• No usar guantes cerca de la llama; lavar o desinfectar las manos.
• Usar etanol solo con el mechero apagado.

Técnica de Cultivo Aséptico

• Evitar movimientos que alteren el campo estéril.
• Mantener tapas y cierres dentro del campo, sin apoyarlos en la mesa.
• Esterilizar materiales (cuellos de botellas, herramientas) al pasarlos por la llama.
• Usar utensilios desechables o esterilizar los reutilizables antes y después de cada uso.

Descontaminación y Gestión de Residuos

Descontaminación y Eliminación de Residuos

• Esterilizar y cerrar correctamente el material reutilizable.
• Desechar el material usado en contenedores biológicos.
• Apagar el mechero y limpiar la superficie con etanol o lejía (dilución 10:1) al final del trabajo.
• Las muestras se conservan en cámaras frías o congeladores (–20 °C, –80 °C).

Eliminación de Residuos y Protección Ambiental

En el laboratorio de microbiología se generan residuos urbanos, sanitarios no específicos y residuos de riesgo específico, además de algunos regulados por normativas especiales.

• La esterilización se realiza mediante autoclave o incineración.

Niveles de Bioseguridad (BSL)

La clasificación de los agentes biológicos se basa en el riesgo que representan para las personas y la comunidad.

Medidas Generales de Seguridad y Actuación ante Accidentes

Medidas Generales de Seguridad

• Transporte de muestras: En bandejas cerradas o neveras transportables.
• Ropa protectora: Uso de bata, guantes (evitando contacto con fuego), gafas y mascarilla si hay riesgo de aerosoles, y pelo recogido.
• Prohibido: Comer, beber o fumar en el laboratorio.
• Lavado de manos: Al finalizar la jornada, al salir del laboratorio, tras salpicaduras y después de quitarse los guantes.
• Heridas o cortes: Deben estar cubiertos y se deben usar guantes.

Actuación ante Accidentes o Incidentes

• Vertido químico: No inhalar vapores. Neutralizar con arena, cal, sosa diluida o carbonato sódico.
• Salpicadura en piel/ojos: Quitar la ropa contaminada y lavar con abundante agua.
• Quemadura: Lavar con agua fría, sin aplicar cremas ni ungüentos.
• Intoxicación:
  • Inhalación: Alejarse de la fuente.
  • Ingestión: No provocar el vómito; conservar el envase y esperar atención médica.
  • Contacto: Lavar con agua y quitar la ropa contaminada.
• Fuego: Mantener la calma, avisar, cerrar el gas y apagar aparatos eléctricos.

Derrames Biológicos

• Pequeño volumen y microorganismos habituales: Cubrir con papel, aplicar lejía, recoger con guantes y desechar en contenedor rígido.
• Gran volumen o microorganismos especiales: Usar EPI completo (bata, guantes, gafas, gorro, mascarilla, calzado), aplicar lejía y limpiar superficies.
• El textil manchado debe retirarse y lavarse con programa de agua caliente.

Conceptos Epidemiológicos

Cadena Epidemiológica o Cadena de Infección

Para que ocurra una enfermedad infecciosa deben existir tres eslabones:

1. Reservorio: Hábitat natural donde el agente biológico vive y se multiplica. Ejemplos: suelo, agua, vegetación, humanos enfermos o portadores, animales (zoonosis).

Fuente de Infección

Lugar donde está el microorganismo ocasionalmente y desde donde pasa al hospedador.

2. Vías de Transmisión: Medio por el que el agente pasa al hospedador.

Vías Directas

• Aérea/respiratoria: Aerosoles, gotitas de Flügge.
• Sexual.
• Parenteral: Transfusiones, cortes, jeringuillas.
• Vertical: Placenta o parto.
• Fecal-oral.

Vías Indirectas

• Fecohídrica (agua contaminada).
• Alimentaria.
• Por fómites: Objetos contaminados (juguetes, ropa, cepillos).
• Por vectores: Artrópodos, roedores, etc.

3. Individuo Susceptible: Persona o animal vulnerable a la infección.

Clasificación de Enfermedades

• Enfermedades Transmisibles: Se propagan entre individuos o animales por vías directas o indirectas.
• Enfermedades Contagiosas: Se transmiten directamente de persona a persona.

Clasificación de Enfermedades Infecciosas

• Esporádicas: Aparecen ocasionalmente en algunos individuos.
• Endémicas: Se mantienen de forma estable en una población.
• Epidémicas: Afectan simultáneamente a muchas personas en una región.
• Pandémicas: Se propagan por varios países o afectan a gran parte del mundo.

Indicadores Epidemiológicos

• Prevalencia: Mide el número de casos existentes (nuevos y antiguos) de una enfermedad en una población y momento determinados.
• Incidencia: Mide el número de casos nuevos que aparecen en una población durante un periodo determinado.

Ambos indicadores pueden expresarse:

• Por cada 1000 habitantes.
• En % (por 100 habitantes).

Estructura Bacteriana

Formas Bacterianas

• Cocos: Forma esférica. 0,5–2 µm.
• Bacilos: Forma alargada o cilíndrica. 0,2–2 µm × 2–20 µm.
• Helicoidales: Forma espiralada o curvada. Hasta 10–15 µm.

Componentes Bacterianos

Elementos Obligados

Pared celular, Membrana citoplasmática, Citoplasma, Ribosomas, Cromosoma (nucleoide).

Elementos Facultativos

Inclusiones, Plásmidos, Glicocálix, Cápsula, Flagelos, Pili, Esporas.

Pared Celular

Estructura rígida que da forma y protección. Contiene principalmente peptidoglicano o mureína.

Bacterias Gram Positivas (G+)

• Peptidoglicano: 40–90% del peso seco (capa gruesa).
• Contienen ácidos teicoicos y lipoteicoicos unidos a la pared y la membrana.

Bacterias Gram Negativas (G–)

• Peptidoglicano: 5–10% (capa delgada).
• Poseen membrana externa adicional:
  • Hoja externa: Lipopolisacárido (LPS).
  • Hoja interna: Fosfolípidos.
• Espacio periplásmico entre ambas membranas.

Estructura del LPS

• Lípido A: Lipídico; actúa como endotoxina (causa shock séptico).
• Región central (R): Oligosacáridos.
• Antígeno O: Polisacárido; determina el serogrupo bacteriano.

Funciones de la Pared Celular

• Determina la morfología bacteriana.
• Permite la diferenciación por tinción de Gram.
• Protege frente a la presión osmótica.
• Es diana de antibióticos (ej. penicilinas).
• Contiene determinantes antigénicos (LPS, ácidos teicoicos, peptidoglicano, manosa…).

Bacterias Ácido-Alcohol Resistentes (AAR)

Poseen una pared rica en lípidos (ácidos micólicos) que forma una capa externa hidrófoba. No se tiñen fácilmente ni se decoloran. Ejemplos: Mycobacterium spp. y Nocardia spp.

Bacterias sin Pared Celular

Carecen de pared y poseen esteroles (colesterol) que estabilizan la membrana. Ejemplos: Mycoplasma spp. y Ureaplasma spp.

Membrana Citoplasmática

Composición

• Fosfolípidos (40%).
• Proteínas (60%): Integrales o periféricas, incluyendo permeasas (transporte y síntesis de peptidoglicano).
• Glúcidos asociados a proteínas o lípidos.
• Hopanoides: Estabilizan la membrana.
• No contiene esteroles, salvo en Mycoplasma.

Funciones

• Barrera osmótica selectiva.
• Biosíntesis de componentes celulares.
• Metabolismo energético (cadena respiratoria).
• Recepción de señales químicas.
• Transporte activo y pasivo de sustancias.

Citoplasma Bacteriano

Matriz coloidal compuesta por:

• Agua (≈85%).
• Principios inmediatos (azúcares, lípidos, proteínas).
• Sales minerales y enzimas.
• Ribosomas.
• Inclusiones.
• Genoma bacteriano.

Ribosomas

Muy abundantes, dispersos o en grupos (polisomas). Formados por ARNr (80%) y proteínas (20%). Sedimentación 70S, con subunidades 50S y 30S. Lugar de síntesis proteica.

Nucleoide

No tiene membrana nuclear. Contiene el cromosoma bacteriano: ADN circular, bicatenario y súperenrollado.

Plásmidos

Pequeñas moléculas de ADN circular, independientes del cromosoma. Se replican por sí mismos y pueden transmitirse:

• Verticalmente: A células hijas.
• Horizontalmente: Entre bacterias (conjugación).

Tipos de Plásmidos

• Conjugativos: Poseen genes para el pili sexual y la transferencia genética.
• De resistencia (R): Codifican enzimas inactivadoras de antibióticos.
• De virulencia: Contienen genes de factores patógenos (toxinas, cápsula, bacteriocinas).
• Degradativos: Codifican enzimas que neutralizan sustancias tóxicas.

Inclusiones Citoplasmáticas

• Vacuolas: Contienen líquidos o gases, rodeadas de una membrana.
• Granulaciones: Inclusiones sólidas, reservas de energía o nutrientes. Visibles al microscopio óptico.
  • Gránulos de polifosfato o volutina: Reserva de energía.
  • Gránulos de glucógeno: Reserva de carbono.
  • Ácido poli-β-hidroxibutírico: Reserva de carbono y energía.

Mesosomas

Invaginaciones de la membrana citoplasmática. Más frecuentes y grandes en Gram (+); más pequeños en Gram (–). Pueden ser artefactos de tinción, pero también cumplir funciones celulares.

Funciones de los Mesosomas

• Formación del tabique (septo) durante la división celular.
• Anclaje del cromosoma y plásmidos.
• Posible función secretora (producción de exoenzimas).

Estructuras Superficiales Facultativas

Glicocálix

Cubierta facultativa, de estructura mal definida, poco adherida a la superficie bacteriana. De naturaleza homopolisacárida y con alto contenido acuoso.

• Funciones:
  • Adherencia bacteriana: Esencial para fijarse a superficies lisas no descamativas (dientes, catéteres). Ejemplo: Streptococcus mutans.
  • Defensa: Dificulta la acción de fagocitos, anticuerpos, enzimas y antibióticos.

Cápsula

Estructura facultativa, bien definida y firmemente adherida. Gel hidrofílico de naturaleza polisacárida. Se observa mediante tinción negativa.

Ejemplos: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis.

Funciones de las Cápsulas

• Protección bacteriana.
• Evita la fagocitosis.
• Oculta antígenos superficiales.
• Favorece la adherencia al hospedador.
• Resistencia antimicrobiana: Disminuye la permeabilidad.

Flagelos

Elementos facultativos, comunes en bacilos, responsables de la movilidad bacteriana. Su longitud supera el tamaño del cuerpo bacteriano.

Clasificación según la Disposición de Flagelos

Estructura de los Flagelos

• Filamento (Antígeno H): Parte externa, compuesta por flagelina (proteína helicoidal).
• Gancho o codo: Región intermedia y articulada. Permite movilidad multidireccional.
• Cuerpo basal: Cilindro central con anillos de anclaje insertados en la membrana y pared celular.

Pili o Fimbrias

Estructuras facultativas, filamentosas y no móviles. Más comunes en Gram (–). Formadas por pilina (proteína).

1. Pili Comunes o Fimbrias

Filamentos rígidos y cortos (0.5–2 µm). Muy numerosos (100–200 por bacteria).

• Funciones: Adherencia a superficies (hematíes, glicocálix epitelial) y determinantes antigénicos.

2. Pili Sexuales

Filamentos más largos (hasta 20 µm), flexibles y escasos (1–4 por célula).

• Función: Participan en la conjugación bacteriana, permitiendo la transferencia horizontal de ADN.

Endosporas

Formas de resistencia adoptadas por algunas bacterias (principalmente bacilos, como Clostridium y Bacillus) frente a condiciones adversas (carencia de nutrientes, desecación, frío o calor extremo, agentes químicos). Se forman por esporulación o esporogénesis.

Características y Propiedades

• Estructuras redondeadas u ovaladas, refringentes, situadas dentro de la célula.
• Contienen antígenos específicos.
• Elevadas concentraciones de calcio, que aumentan su resistencia.
• Pueden conservar viabilidad durante años.

Germinación

Proceso inverso a la esporulación: la espora vuelve a ser una célula vegetativa. Ocurre cuando el medio vuelve a ser favorable (presencia de agua y nutrientes).

Técnicas de Tinción en Microbiología

Pasos Generales para Toda Tinción

1. Preparación del frotis (extensión): Colocar la muestra, mezclar si es necesario, y secar al aire (nunca directamente al fuego).
2. Fijación de la muestra: Adherir las células al porta y coagular su protoplasma. Puede ser por calor (pasando el porta por la llama) o con metanol (ideal para cultivos líquidos).
3. Tinción: Cubrir la extensión con abundante colorante y dejar actuar el tiempo indicado.
4. Lavado: Lavar suavemente con agua, dejando que caiga sobre un extremo del porta inclinado.
5. Secado: Quitar el exceso de agua golpeando suavemente. Secar al aire o con papel secante (sin frotar).
6. Observación microscópica: Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la muestra. Observar con el objetivo de inmersión (100x).

Tinción Simple

Utiliza un solo colorante. Si tiñe las células, es directa. Si tiñe el fondo, es negativa.

• Objetivo: Observar la morfología, tamaño y agrupación de los microorganismos.

Técnica Simple

1. Preparar el frotis y fijar.
2. Aplicar el colorante (ej. Fucsina fenicada, Cristal Violeta, Azul de Metileno).
3. Lavar con agua y secar.
4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión (sin cubre).

Tinción Negativa (Nigrosina)

• Objetivo: Observar forma y tamaño bacteriano sin teñir las células, solo el fondo. Especialmente útil para visualizar cápsulas.

Técnica

1. Colocar 1–2 asas de Nigrosina en un extremo del porta.
2. Añadir una pequeña muestra del cultivo y mezclar.
3. Usar otro porta en ángulo de 45° para extender como un frotis de sangre.
4. Dejar secar al aire (no se fija ni se lava).
5. Observar con aceite de inmersión y con cubreobjetos.

• Resultado: Las bacterias aparecen incoloras sobre un fondo oscuro.

Tinciones Diferenciales

Utilizan varios colorantes que reaccionan de forma diferente con distintos tipos de células, permitiendo su clasificación.

Tinción de Gram

• Objetivo: Distinguir bacterias Gram positivas (G+) y Gram negativas (G–) según su pared celular.
• Fundamento químico: Las Gram (+) tienen una pared gruesa de peptidoglicano que retiene el complejo cristal violeta-yodo tras la decoloración con alcohol. Las Gram (–) tienen una pared delgada y una membrana externa lipídica que se disuelve, eliminando el colorante primario.
• Resultado: Gram (+): violetas. Gram (–): rosadas.

Técnica de Gram

1. Aplicar cristal violeta (1 min).
2. Lavar con agua.
3. Cubrir con Lugol (mordiente) (1 min).
4. Lavar nuevamente con agua.
5. Decolorar con alcohol-acetona (30 s).
6. Lavar abundantemente con agua.
7. Aplicar safranina (color de contraste) (1–2 min).
8. Lavar y dejar secar.
9. Observar con aceite de inmersión (sin cubre).

Importancia de la Tinción de Gram

• Identificación rápida de bacterias clínicas.
• Base para elegir tratamiento antibiótico.
• Punto clave en la taxonomía bacteriana.

Tinción BAAR (Ziehl-Neelsen)

• Objetivo: Diferenciar bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR) de las que no lo son.
• Fundamento: Las bacterias con alto contenido de ácidos micólicos (lípidos) en la pared (ej. Mycobacterium) impiden la penetración de colorantes acuosos. La fucsina fenicada caliente penetra y, una vez fijada, no se elimina con ácido ni alcohol.
• Bacterias típicas: Mycobacterium tuberculosis, Nocardia spp.

Técnica Resumida (Ziehl-Neelsen)

1. Preparar, secar y fijar la extensión.
2. Cubrir con fucsina fenicada y calentar 5 min hasta emisión de vapores (sin hervir).
3. Lavar con agua.
4. Decolorar con alcohol clorhídrico (3-5%) durante 2 min.
5. Lavar.
6. Contrastar con azul de metileno (1 min).
7. Lavar, secar y observar.

• Resultados: BAAR: rojos (fucsina). No BAAR: azules (azul de metileno).

Tinciones Estructurales

Endosporas (Wirtz-Conklin o Schaeffer-Fulton)

• Objetivo: Observar forma y localización de endosporas.
• Fundamento: El verde malaquita caliente penetra en la espora y no se elimina con el lavado. Las células vegetativas se tiñen luego con safranina.

Técnica

1. Preparar y fijar cultivos en fase estacionaria.
2. Cubrir con verde malaquita (5%) y calentar 5 min.
3. Lavar con agua.
4. Contrastar con safranina 0,5% (30 s).
5. Lavar, secar y observar.

• Resultados: Esporas: verdes. Células vegetativas: rosas.

Tinción de Cápsulas

• Objetivo: Visualizar cápsulas bacterianas sin dañarlas.
• Fundamento: Las cápsulas no se tiñen con colorantes básicos. Se observan mediante tinción negativa (Nigrosina).
• Resultados: Fondo: oscuro. Célula: clara. Cápsula: halo transparente alrededor de la célula.

Tinción Corpúsculos Metacromáticos (Loeffler)

• Objetivo: Demostrar y observar gránulos metacromáticos (o gránulos de volutina).
• Fundamento: Los corpúsculos (reservas de polifosfatos) tienen gran afinidad por colorantes básicos, tiñéndose más intensamente que el citoplasma.

Técnica

1. Preparar, secar y fijar suavemente la muestra.
2. Aplicar azul de metileno de Loeffler (3–5 min).
3. Lavar con agua y secar.
4. Observar con objetivo de inmersión.

• Resultados: Corpúsculos: azul intenso. Citoplasma: azul claro.

Tinción de Flagelos (Leifson)

• Objetivo: Visualizar flagelos y determinar su número y disposición.
• Fundamento: Los flagelos son demasiado finos. El ácido tánico los recubre, aumentando su grosor, y luego se tiñen con rosanilina.

Tinciones Directas con Fluorocromos

Tinción con Naranja de Acridina

• Fundamento: El fluorocromo se une a los ácidos nucleicos: ADN doble cadena → fluorescencia verde; ARN o ADN monocatenario → fluorescencia roja.
• Objetivo: Detectar bacterias sin pared (micoplasmas) o confirmar presencia bacteriana en hemocultivos.
• Resultados: Bacterias y núcleos → fluorescencia amarillo/naranja sobre fondo oscuro.

Tinción con Auramina-Rodamina

• Fundamento: Alternativa fluorescente a Ziehl-Neelsen. Los fluorocromos se unen a los ácidos micólicos de las paredes celulares de BAAR, sin necesidad de calor.
• Objetivo: Distinguir bacterias ácido-alcohol resistentes mediante fluorescencia.

Técnica

1. Preparar y fijar la muestra.
2. Cubrir con auramina-rodamina (12–15 min), lavar y secar.
3. Decolorar con alcohol/ácido clorhídrico 3–5% (3 min).
4. Contrastar con permanganato potásico 0,5% (2–3 min).
5. Lavar, secar y observar con microscopio de fluorescencia.

• Resultados: BAAR → fluorescencia amarillo-verdosa intensa. Fondo → oscuro.

Requerimientos Nutricionales y Crecimiento Bacteriano

Tipos de Nutrientes Necesarios

• Nutrientes básicos: Elementos indispensables (H₂O, C, N, P, S, K, Mg, Ca, Na, Fe, etc.).
• Metabolitos esenciales: Productos del catabolismo energético. Ejemplo: ácido pirúvico.
• Factores de crecimiento: Compuestos que la bacteria no puede sintetizar (aminoácidos, vitaminas).
• Factores estimulantes: Sustancias no indispensables, pero que aceleran la multiplicación.

Clasificación Nutricional Combinada

Modo de Ingestión de Nutrientes

Requerimientos Ambientales

Requerimientos de Oxígeno (O₂)

Requerimientos de Dióxido de Carbono (CO₂)

• La mayoría requiere pequeñas cantidades. Algunas necesitan altas concentraciones (5–10%).
• Capnófilos: Microorganismos que crecen mejor con CO₂ (Ejemplos: Neisseria, Brucella).

Presión Osmótica (Tolerancia a sales – NaCl)

Temperatura

pH y Humedad

• pH óptimo bacterias: 7.2.
• pH óptimo hongos: 5–6.
• Humedad: El 80% del peso bacteriano es agua.
• Xerófilos: Microorganismos que pueden crecer en ambientes muy secos.

Crecimiento Bacteriano

Se reproducen por fisión binaria, generando crecimiento exponencial (2ⁿ).

• Tiempo de generación: Tiempo que tarda la población en duplicarse (15–30 min en patógenos comunes).

Fases de Crecimiento en Cultivo Discontinuo

Cultivo Continuo

Mantiene una población en fase exponencial prolongada. Se realiza en un quimiostato, que añade continuamente medio fresco y elimina productos de desecho.

Medios de Cultivo

Composición Básica

• Agua (H₂O).
• Peptonas (fuente de C, N y S).
• Carbohidratos (fuente de C y energía).
• Extractos (carne, levadura).
• Sales minerales (NaCl, etc.).
• Amortiguadores de pH.
• Agentes especiales (sales biliares, colorantes, reductores).

Agentes Solidificantes

Clasificación de los Medios de Cultivo

Según Consistencia Física

Según Composición Química

Según su Función

Preparación y Conservación de Medios

Hoy en día se emplean medios deshidratados comerciales: solo se añade agua destilada y se esteriliza.

• Los medios líquidos se disuelven, envían a tubos/matraces y se esterilizan.
• Los medios sólidos se preparan añadiendo agar (1.5%), se calientan a 100 °C para fundir y se esterilizan.

Si se añaden compuestos termolábiles (vitaminas, antibióticos): se esterilizan por filtración y se incorporan al medio atemperado.

• Conservación: A 4 °C para evitar deshidratación.

Siembra e Incubación de Microorganismos

Siembra de Microorganismos

Consiste en inocular material microbiológico en un medio adecuado para su crecimiento.

Instrumentos

• Asa de siembra
• Hilo o aguja de siembra
• Pipeta Pasteur
• Asa de Drigalsky
• Cayado

Tipos de Siembra

Condiciones de Incubación

• Placas invertidas (evita condensación).
• 35–37 °C, 75% humedad, 18–24 h.
• Separar placas entre sí y de las paredes.
• Atmósfera adecuada (aerobia, anaerobia, CO₂, etc.).

Cultivo en Anaerobiosis

Se realiza en jarra anaerobia con catalizador de paladio y sobre Gas-Pak (bicarbonato sódico + ácido cítrico).

• Al añadir agua → se genera CO₂ y se consume O₂.
• Se usa indicador químico que cambia de color al asegurar la anaerobiosis.

Hemocultivos

Hoy se emplean sistemas automatizados de lectura continua.

Ambos mantienen 36 ± 1 °C con agitación continua y monitorización constante.

Tipos de Frascos

• Aerobios y anaerobios facultativos o estrictos.
• Pediátricos: Para volúmenes pequeños.
• Selectivos: Para micobacterias (medio Middlebrook 7H9) y hongos.

Composición de Frascos de Hemocultivo

• Medios enriquecidos con nutrientes.
• Anticoagulante: SPS (polianetolsulfonato de sodio). Neutraliza suero bactericida y algunos antibióticos.
• Carbón o resinas: Neutralizan antibióticos y el complemento.
• Algunos incorporan agentes líticos para liberar bacterias intracelulares.

Técnicas de Aislamiento y Recuento

Técnicas de Aislamiento

Permiten obtener cultivos puros (poblaciones de microorganismos con propiedades idénticas).

• El aislamiento se logra mediante la obtención de colonias separadas sobre un medio de cultivo adecuado.
• Técnicas utilizadas: Diluciones sucesivas y siembra en superficie, o agotamiento de asa (en estrías o en zigzag).

Métodos de Recuento

1. Determinación de la Masa Celular

• Medición del peso: Húmedo o seco (poco usado).
• Métodos analíticos: Determinación de nitrógeno total, ADN, proteínas, etc.
• Métodos turbidimétricos: Espectrofotometría, nefelometría, escala de McFarland.

2. Determinación del Número de Células

• Recuento en cámara: Cámara de Petroff-Hausser o Neubauer.
• Recuento celular automático: Contador de Coulter, Citómetro de flujo.
• Recuento manual de células viables: Diluciones seriadas + siembra en placa.

Espectrofotometría

Método estimativo para conocer la concentración de microorganismos.

• Se mide la densidad óptica (D.O.) a 600 nm. Las partículas dispersan la luz proporcionalmente a su concentración.
• Mayor absorbancia → menor transmitancia.
• Existe una relación lineal entre la D.O. y el número de células (hasta una Abs. de 0,3).

Patrones de McFarland

Permiten estimar la densidad bacteriana comparando visualmente la turbidez con tubos patrón (reacción de BaCl₂ + H₂SO₄ → BaSO₄).

• Deben agitarse antes de usar y compararse sobre un fondo blanco con línea negra horizontal.
• El Patrón 0,5 McFarland corresponde a ≈ 1,5 × 10⁸ células/mL de E. coli.
• Usado en la preparación de inóculos bacterianos para pruebas de sensibilidad antimicrobiana.

Uso de Cámaras de Recuento

Se utiliza una cámara especial (Neubauer o Petroff-Hausser) con una cavidad de volumen conocido subdividida en cuadrados. Permite recuento de células viables y no viables mediante microscopía.

Recuento de Orinas: Urinocultivo

La positividad del cultivo se basa en criterios cuantitativos.

Procesamiento Inicial

1. Análisis macroscópico.
2. Análisis microscópico: Centrifugar 10 mL de orina, observar una gota del sedimento.

Indicadores de Infección

• Bacterias: Siempre hay flora acompañante; se debe analizar pronto para evitar falsos positivos.
• Leucocitos: Hombres: >1–2/campo. Mujeres y niños: >2–7/campo → piuria.
• Hematíes: 3–4/campo → hematuria significativa.
• Hongos: Candida albicans es la más frecuente.
• Protozoos: Trichomonas vaginalis.

Cultivo e Interpretación Cuantitativa

Se realiza con asa calibrada (5–10 µL) en agar CLED y a veces MacConkey, usando técnica de estría.

Criterio de Kass

• ≤ 10⁴ UFC/mL: Urinocultivo negativo.
• 10⁴–10⁵ UFC/mL: Dudoso (repetir).
• ≥ 10⁵ UFC/mL: Urinocultivo positivo.

Método Semicuantitativo (Laminocultivo o Slide)

Lámina plástica con dos medios adheridos (CLED y MacConkey). Permite identificar bacterias causantes de infecciones urinarias (ITU).

Conceptos Adicionales y Respuestas de Repaso

RA1: Conceptos de Seguridad y Epidemiología

1. Fómites: Son objetos inanimados que llevan microorganismos patógenos y, por lo tanto, pueden servir como fuente de infección. Ejemplos: móvil, balón.
2. Enfermedades transmisibles vs. contagiosas: Las transmisibles se pueden transmitir entre individuos por vía indirecta o directa, mientras que las contagiosas se transmiten directamente de persona a persona.
3. Medidas de seguridad: Transporte de muestras en bandejas cerradas o neveras transportables. Ropa protectora: uso de bata, guantes (excepto cerca del fuego), gafas y mascarilla si hay riesgo de aerosoles, y pelo recogido. Prohibido: comer, beber o fumar en el laboratorio. Lavado de manos: al finalizar la jornada, al salir del laboratorio, tras salpicaduras y después de quitarse los guantes. Heridas o cortes: deben estar cubiertos y se deben usar guantes.
4. Reservorio vs. Fuente de infección: El reservorio es el hábitat donde está el microorganismo y se multiplica de forma natural. La fuente de infección es donde está ocasionalmente el microorganismo y por donde llega al hospedador.
5. Asepsia: Es una técnica de saneamiento que busca destruir los microorganismos patógenos que hay en las personas, animales, superficies, ambiente o cosas. En un laboratorio se debe mantener el local, las superficies y equipos en correcta higiene, se usa instrumental y recipientes, soluciones, medios y reactivos esterilizados, y se realizan todas las operaciones siguiendo procedimientos asépticos.

RA2: Estructura y Tinciones Bacterianas

1. Endosporas: Son formas de resistencia que adoptan algunas bacterias en situaciones adversas. Se forman en un proceso de esporogénesis y son tan resistentes a los factores ambientales que conservan su vitalidad durante años. Aparecen en situaciones como deficiencia nutricional, desecación, frío o altas temperaturas. Los géneros Clostridium y Bacillus producen las esporas bacterianas.
2. Diferencia en la Tinción de Gram: Las bacterias Gram (+) se tiñen diferente debido a la diferencia química de su pared celular, ya que estas tienen mayor contenido de peptidoglicano que las Gram (–). Por ello, cuando en la técnica se decolora con alcohol-acetona, las Gram (+) sufren deshidratación y sus poros se contraen, impidiendo la salida del complejo cristal violeta-yodo.
3. Tinción Ácido-Alcohol Resistente (Ziehl-Neelsen): Es una tinción diferencial que permite distinguir aquellas bacterias cuyas paredes celulares contienen un elevado porcentaje de lípidos (ácidos micólicos), siendo por ello impermeables a los colorantes acuosos. Esta característica hace que estos microorganismos no se coloreen bien con la tinción de Gram. La tinción Ziehl-Neelsen consigue que este tipo de bacterias, una vez teñidas, resistan a la decoloración por ácidos y alcoholes (BAAR). El principal género bacteriano es Mycobacterium spp., aunque Nocardia spp. y Actinomyces spp. también tienen cierto grado de ácido-alcohol resistencia.

Fundamento y Aplicación Clínica de Ziehl-Neelsen

Debido a esta gruesa capa de compuestos lipídicos en su pared, se deben utilizar métodos especiales para forzar la entrada del primer colorante (fucsina fenicada). Por ello, se calienta la preparación cubierta con este colorante. Una vez que el colorante ha penetrado, la decoloración con ácido y alcohol resulta tan difícil que dichos microorganismos permanecen coloreados de rosa, mientras que el resto de las bacterias tomarán el colorante de contraste (azul de metileno). Su aplicación clínica permite diferenciar microorganismos patógenos como Mycobacterium tuberculosis en muestras patológicas como esputos y secreciones bronquiales.

Tinción con Auramina-Rodamina (Fluorescencia)

Los fluorocromos auramina y rodamina se unen a los ácidos micólicos de las paredes celulares de BAAR, sin necesidad de calor.

RA3: Requerimientos y Medios de Cultivo

1. Anaerobios facultativos vs. Anaerobios aerotolerantes: Ambos corresponden a unas condiciones fisicoquímicas para el desarrollo de los microorganismos respecto al O₂. Se diferencian en:
   • Anaerobios facultativos: No necesitan el O₂ para su normal crecimiento, pero si está presente lo usan metabólicamente.
   • Anaerobios aerotolerantes: Anaerobios que pueden tolerar la presencia de O₂, pero son incapaces de usarlo metabólicamente.
2. Agar Chocolate: Es un medio sólido, enriquecido, complejo y no selectivo. Es sólido porque contiene agar-agar; enriquecido porque incluye sangre calentada que libera los factores X (hemina) y V (NAD) necesarios para el crecimiento de bacterias exigentes (como Neisseria y Haemophilus); complejo porque la composición química exacta de la sangre no se conoce con precisión; y no selectivo porque no contiene inhibidores.
3. Sistema BD Bactec FX: Detecta hemocultivos positivos mediante un método automatizado basado en la detección del CO₂ producido por el metabolismo bacteriano. Cada frasco contiene un sensor que cambia de fluorescencia o color cuando aumenta la concentración de CO₂ disuelto, lo que indica crecimiento microbiano. El equipo monitoriza constantemente los frascos incubados y, al detectar este cambio, envía una señal automática de positividad.

RA4: Técnicas de Recuento e Incubación

1. Patrones de McFarland: Consiste en una serie de tubos herméticamente cerrados, con una escala de turbidez generada por un precipitado de sulfato de bario (BaSO₄). El ojo humano percibe mejor la turbidez comparativa poniendo los tubos contra un fondo blanco con una línea negra horizontal. El patrón 0,5 de McFarland corresponde aproximadamente a una suspensión homogénea de Escherichia coli de 1.5 x 10⁸ células por mL y se usa para la preparación de inóculos bacterianos para pruebas de sensibilidad antimicrobiana.
2. Incubación de placas: Las placas de cultivo se incuban de forma invertida para evitar que la condensación de agua en la tapa caiga sobre el medio sólido, lo que podría dispersar las colonias y alterar su crecimiento. Así se reduce el riesgo de contaminación por gotas. Las condiciones de incubación se mantienen a 35-37 °C, con 75% de humedad y una duración de 18–24 horas aproximadamente.
3. Cultivo en anaerobiosis: Actualmente, la atmósfera anaerobia se genera mediante sistemas cerrados con sobres o generadores químicos (como los GasPak, que contienen borohidruro sódico y ácido cítrico) que liberan hidrógeno y dióxido de carbono al reaccionar con el oxígeno del interior del recipiente, eliminándolo gracias a un catalizador de paladio que forma agua. Las placas se colocan dentro de un jarro o cámara anaerobia hermética con un indicador que vira de color para confirmar la ausencia de oxígeno.
4. Laminocultivo: Permite realizar un recuento semicuantitativo de microorganismos, especialmente útil en el diagnóstico de infecciones urinarias. Consiste en una lámina plástica recubierta por ambas caras con medios de cultivo diferentes que se introduce directamente en la orina para luego incubarla; según el número y tamaño de las colonias, se estima la concentración bacteriana en UFC/mL. Otro método de recuento del mismo tipo es el urinocultivo con asa calibrada.