Fisiología Animal: Métodos Experimentales, Biosensores y Ética en Investigación

Seminario 1: Fundamentos y Aplicaciones de los Biosensores

¿Qué es un Biosensor?

Un biosensor es un dispositivo de análisis compacto que incorpora un elemento biológico asociado a un sistema de transducción, permitiendo detectar sustancias mediante la interacción entre el elemento de reconocimiento y el analito.

Componentes Clave de un Biosensor

• Analito: La sustancia a detectar.
• Receptor biológico: Elemento que reconoce el analito (ej., ADN o proteínas).
• Sensor: Interpreta la reacción.
• Detector: Traduce la señal del sensor.

Criterios de Clasificación de Biosensores

Los biosensores se clasifican en base a:

• El tipo de receptor biológico y sistema de transducción.
• La interacción del elemento de reconocimiento y el analito (biocatalizadores, bioafinidad).
• La detección de la interacción (directa o indirecta).
• El elemento de reconocimiento (ej., enzimas, anticuerpos).
• Los sistemas de transducción (electroquímico, óptico).

Propiedades Esenciales de un Biosensor

Un biosensor debe poseer las siguientes propiedades:

• Sensibilidad: Capacidad de detectar pequeñas cantidades del analito.
• Fiabilidad, especificidad y precisión.
• Selectividad y estabilidad.
• Su reacción debe ser independiente de factores como temperatura, presión, etc.
• Debe ser portable, de bajo costo y capaz de usar pequeños volúmenes.
• Debe permitir el multianálisis.

Elementos Biológicos para Sensores Biocatalíticos

Los elementos biológicos que se pueden utilizar para crear sensores biocatalíticos incluyen:

• Enzimas
• Células completas
• Orgánulos subcelulares
• Tejidos

(Nota: Estos elementos presentan elevada actividad, pero tienen baja sensibilidad, selectividad limitada y dan una respuesta lenta).

Funcionamiento de los Biosensores Biocatalíticos

En estos biosensores, el elemento biológico cataliza una reacción química específica con el analito, generando un producto medible (por ejemplo, cambios en pH, oxígeno, etc.).

Sensores de Bioafinidad

Se basan en la interacción del analito de interés con el elemento de reconocimiento, sin que exista transformación catalítica, sino que se produce una reacción de equilibrio. Pueden ser los receptores, las lectinas, los ácidos nucleicos o los anticuerpos (estos últimos se unen selectivamente a los antígenos y son usados por su bajo coste, rápida respuesta y elevada sensibilidad y especificidad).

Sistema de Transducción en Biosensores

El sistema de transducción es el elemento que convierte las variaciones de las propiedades físicas o químicas, producidas por la interacción entre el elemento de reconocimiento y el analito, en una señal que puede ser amplificada, almacenada y registrada. Esta señal necesita ser tratada por un software para su procesamiento. Existen distintos tipos:

• Electroquímico
• Conductimétrico
• Potenciométrico (variaciones en el potencial eléctrico)
• Amperométrico
• BW (Bulk Acoustic Wave)
• SAW (Surface Acoustic Wave)

Parámetros Medibles y Ejemplos de Biosensores

Parámetros medibles: Glucosa, pH, oxígeno, biomarcadores inflamatorios, gases, temperatura, presencia de patógenos, etc.

Ejemplos de Aplicación de Biosensores:

• El biosensor de glucosa usa una enzima (glucosa oxidasa) como receptor y un electrodo como transductor. La enzima cataliza la oxidación de glucosa, generando una señal eléctrica proporcional a la concentración de glucosa.
• Biosensores para detectar coronavirus: Como el basado en grafeno, que emplea un receptor biológico (por ejemplo, un anticuerpo específico) y un transductor óptico o electroquímico para detectar el virus de forma rápida y precisa.
• Prueba de embarazo: Busca una hormona en la orina mediante anticuerpos.
• Detección de componentes o contaminantes.

Seminario 2: Caracterización de Modelos Animales en Neurociencia

Caracterización de Ratones Mutantes con Déficits de Aprendizaje y/o Memoria

Laberinto de Agua de Morris

• Descripción: Piscina circular con agua opaca, plataforma oculta bajo el agua, señales visuales externas. El ratón debe aprender a encontrar la plataforma usando las señales.
• Interpretación: Si el ratón mutante tarda más en encontrar la plataforma o no mejora con los ensayos, sugiere un déficit en memoria espacial.
• Diseño Experimental:
  • Grupos: Grupo control (ratones normales), Grupo mutante.
  • Procedimiento: Entrenar ambos grupos en el laberinto de Morris durante varios días. Medir el tiempo y la distancia para encontrar la plataforma. Realizar la fase de inversión (cambiar la plataforma de lugar) y medir la capacidad de adaptación.
• Resultados Esperados: Si los mutantes muestran mayor tiempo de escape, peor adaptación o más errores, se concluye que presentan déficits de aprendizaje/memoria.

Laberinto en Y

• Descripción: Laberinto con tres brazos (en forma de Y). Se bloquea un brazo durante la exploración inicial, luego se libera y se observa si el ratón explora el nuevo brazo.
• Interpretación: Si el mutante entra repetidamente en brazos ya visitados, indica problemas en memoria de trabajo.

Laberinto en Brazo Radial

• Evalúa la memoria de trabajo a corto plazo. Al principio y al final de cada brazo no hay comida, pero luego sí. El objetivo es que el animal pase únicamente una vez por cada brazo, recordando los que ya ha visitado.

Prueba de Reconocimiento de Objetos Nuevos

• El ratón se coloca en un recinto con dos objetos. Pasado un tiempo, se retira al animal y se cambia un objeto antiguo por uno nuevo. Se mide la capacidad del animal para diferenciar lo nuevo de lo conocido y el tiempo dedicado a la exploración.

Estudio de Compuestos Ansiolíticos o Antidepresivos en Ratones

Para estudiar la aplicabilidad de un compuesto químico de nueva síntesis como fármaco ansiolítico o antidepresivo, se pueden utilizar las siguientes pruebas:

• Interacción social: En el caso de depresión, los animales la evitarán.
• Prueba de desamparo aprendido: Se mide el desarrollo de respuestas pasivas ante un estímulo en las patas del que no pueden escapar.
• Natación forzada: Se mide la inmovilidad en un baño de agua.

Estudio de Déficits Motores en Modelos Animales de Enfermedad Neurodegenerativa

Para evaluar déficits motores, se pueden emplear:

• Análisis de las huellas: Poner tinta en las patas y dejar que el ratón camine por un pasillo; analizar la longitud y simetría de la zancada. Alteraciones en la marcha reflejan problemas motores.
• Prueba de la canasta: Usada para evaluar la coordinación motora y los déficits sensoriomotores en modelos de roedores con trastornos del SNC.
• Ensayo de travesaño elevado: Los ratones se colocan en una viga y su capacidad de atravesarla se considera una medida de su equilibrio. Se usan el deslizamiento de patas y el tiempo de desplazamiento como mediciones.
• Ensayo del cilindro: Cilindro transparente; se cuenta cuántas veces el ratón usa cada pata delantera para tocar las paredes. El uso asimétrico sugiere un déficit motor lateralizado.
• Rotarod: Cilindro giratorio donde se coloca al ratón; se mide el tiempo hasta que cae. Un menor tiempo indica un déficit motor.

Caracterización de la Respuesta Nociceptiva (Dolor) en Modelos de Inflamación

La nocicepción es el proceso fisiológico mediante el cual el sistema nervioso detecta estímulos potencialmente dañinos (nocivos) que pueden causar daño o lesión en los tejidos.

Test de la Placa Caliente

• Material y Procedimiento: Placa que se calienta a temperatura controlada; se mide el tiempo hasta que el ratón retira la pata.
• Interpretación: Una latencia menor indica mayor sensibilidad al dolor.

Test de von Frey (Filamentos)

• Material y Procedimiento: Aplicar filamentos de diferente fuerza en la extremidad inflamada; se mide la fuerza mínima que provoca una respuesta de retirada.
• Interpretación: Un umbral menor indica hipersensibilidad.
• Diseño Experimental:
  • Grupos: Control (sin inflamación), Experimental (con inflamación inducida, por ejemplo, con inyección de carragenina).
  • Procedimiento: Inducir inflamación en un grupo. Realizar los tests de dolor en ambos grupos. Comparar la latencia/umbral de respuesta.
• Resultados Esperados: El grupo inflamado mostrará mayor sensibilidad al dolor (menor latencia/umbral).

Práctica 1: Hiperalgesia Humana y Percepción del Dolor

Psicofísica del Dolor

La psicofísica es el estudio del dolor en humanos. Su principal ventaja es la comunicación con el sujeto, mientras que las desventajas incluyen la variabilidad individual y las limitaciones en la intervención.

Estímulos Nociceptivos

Los estímulos que provocan dolor son mecánicos, químicos y térmicos. Los nociceptores se activan con estímulos bajos y se saturan en un punto. Los nociceptores presentan umbrales más altos para estímulos peligrosos que no avisan de que debemos evitar.

Umbral del Dolor y su Variabilidad

El umbral es el momento en el que se pasa de no sentir dolor a sí sentirlo. La relación estímulo-sensación no siempre es la misma, influenciada por el ambiente, la adrenalina, etc.

Alodinia e Hiperalgesia

Cuando hay una lesión en un tejido, ese lugar concreto dolerá más. Las diferencias son:

• Alodinia: Sensación de dolor producida por un estímulo que no debería producirlo (por ejemplo, la gasa o un algodón).
• Hiperalgesia: Sensación de dolor aumentada de algo que ya nos hacía daño.

Una lesión también genera hinchazón, enrojecimiento, calor (mayor flujo sanguíneo) y pérdida de función. Se liberan sustancias que actúan sobre los nociceptores, aumentando su sensibilidad, lo que se conoce como nociceptor sensibilizado.

Objetivo de la Práctica: Explorar la Sensación de Dolor en la Piel Humana

Se simula una lesión con el aceite de mostaza, una sustancia exógena que activa receptores en los nociceptores, enviando señales al sistema nervioso. El sujeto sentirá quemazón, ya que este aceite penetra, y el dolor se puede cuantificar con escalas numeradas.

Mediciones Pre y Post-Aplicación de Aceite de Mostaza

Se mide antes del aceite con el estímulo y luego con el aceite + el estímulo:

• Estímulos Mecánicos:
  • Palillo: Se mide la hiperalgesia para saber si duele más que el aceite.
  • Gasa/Bastoncillo: Se mide la alodinia; no debería doler, pero se observa si esto cambia después de la aplicación del aceite.
• Estímulos Térmicos: Se coloca un termómetro en el brazo que indicará la temperatura que el sujeto está aguantando mientras se le somete a una luz. La temperatura en la que empieza a sentir dolor es el umbral que se busca.

Cambios Cutáneos Inducidos por el Aceite de Mostaza

El aceite de mostaza también produce cambios en la piel: el nociceptor se activa y libera sustancias que causan un enrojecimiento porque aumenta el flujo sanguíneo. Este enrojecimiento no solo ocurre en la parte donde ha caído el aceite, sino en toda la zona donde se ha distribuido el nociceptor. Así se mide la hiperalgesia primaria (zona de la lesión) y la hiperalgesia secundaria (zona influenciada por el nociceptor).

Práctica 2: Electromiografía Humana y Función Muscular

Registro de Señales Eléctricas Musculares

La electromiografía (EMG) registra las señales eléctricas del músculo esquelético humano, cuya actividad está controlada por neuronas motoras que, al activarse, activan las fibras musculares generando la contracción.

Mecanismo de Contracción Muscular

La contracción de las células musculares se produce porque el potencial de acción llega al axón de las neuronas motoras y se liberan las vesículas que contienen neurotransmisores, dando lugar a un potencial de acción. Este potencial de acción se transmitirá por toda la fibra muscular, lo que provoca la liberación de moléculas de Ca²⁺, generando que los filamentos de actina y miosina interaccionen, permitiendo la contracción de la fibra muscular. Se necesita un potencial de acción y liberación de calcio.

Tipos de Electromiografía

Hay dos tipos de electromiografía:

• Registro con electrodos de aguja: Técnica invasiva, donde se introduce un electrodo fino dentro del músculo para registrar señales.
• Registro de electrodos de superficie: Los electrodos se ponen por encima de la piel y recogen la actividad del músculo que está debajo. En este caso, no se puede aislar la actividad de una fibra concreta.

Colocación de Electrodos de Superficie

Los electrodos que se usan son tres: uno positivo en el medio del músculo y otro negativo en el extremo, ya que las neuronas motoras del músculo se localizan en el centro y se desplazarán hacia el extremo. El positivo captará el potencial de acción mientras que el negativo lo hará después, permitiendo generar una señal eléctrica mayor. También se usa un electrodo de tierra, colocado en un sitio donde no se produzcan señales (hueso), eliminando el ruido producido por los otros electrodos.

Procesamiento de la Señal EMG

También se necesita un amplificador, un filtro y un registro para visualizar la señal digital. Para analizar el registro, hay que identificar la actividad (si está en el centro, los extremos serán el ruido). Hay que medir la frecuencia de las ondas (contar las ondas más altas que el ruido). Se puede medir la frecuencia, que es el número de ondas por segundo (Hz), o la amplitud media de las ondas (la media de todo lo que miden las ondas). Una vez obtenidas, se realizan pruebas para relacionar la señal con la fuerza de contracción.

Estudio de la Fatiga Muscular

Dentro del músculo esquelético, tenemos:

• Fibras rápidas o blancas: Generan fuerzas de contracción más grandes; se fatigan rápido (en músculos donde se realizan saltos, por ejemplo).
• Fibras lentas o rojas: Son capaces de mantener la fuerza de contracción más tiempo (músculos de la espalda).

Estas fibras se activan dependiendo de la fuerza que se desea ejercer. Con la fatiga, la amplitud de registro descendería (fibras rojas más pequeñas), pero la frecuencia aumentaría, lo que indica un mayor número de ondas por fibras rojas.

El Reflejo y su Comparación con la Respuesta Voluntaria

El reflejo consiste en:

1. Activación del receptor sensorial.
2. Envío de información a la médula espinal por medio de una neurona sensorial.
3. La médula contacta con una neurona motora.
4. La neurona motora contacta con las fibras del músculo esquelético.

Comparación de Polaridad y Latencia

• ¿Qué pasa si cambiamos la polaridad de los electrodos?: La señal se invierte.
• Respuesta refleja vs. voluntaria (al golpear en piernas diferentes): El reflejo tiene menos latencia que el voluntario. En el voluntario, la activación no es tan sincrónica, mientras que en el reflejo es puntual y sincrónica.

Fisiología Animal y Consideraciones Éticas en la Investigación

1. ¿Qué es la Fisiología Animal?

Del griego physis (naturaleza) y logos (estudio). Según la RAE, es la ciencia que tiene como objeto el estudio de las funciones de los seres orgánicos. Abarca el estudio de muchos niveles de organización.

• Aristóteles: Corriente filosófica que relaciona el estudio de la naturaleza.
• Jean Fernel: Disciplina científica que estudia el funcionamiento de los seres vivos en la naturaleza.

2. ¿Qué es la Caja de Skinner?

Es un ejemplo de preparación in vivo. Es utilizada para estudiar el condicionamiento de animales que son capaces de relacionar un estímulo con una reacción para recibir una recompensa.

3. Definición de Modelos Computacionales

Es la reconstrucción de una situación experimental, no sobre el animal, sino sobre datos conocidos. Se utiliza la información para desarrollar un modelo en el ordenador que permita estudiar los procesos fisiológicos como si fuera en un animal.

4. ¿Qué son los Comités de Ética?

Son comités de expertos que analizan cada una de las investigaciones que se quieren llevar a cabo y se encargan de asegurarse de que se van a cumplir las condiciones adecuadas.

5. Experimentación con Humanos

Se puede llevar a cabo con personas voluntarias sanas y enfermas. Siempre es necesario:

• Un consentimiento informado.
• Que esté sometido a comisiones éticas.
• Proporcionar libertad absoluta para abandonar el experimento.
• Una justificación sólida para realizar el experimento.
• No se deben utilizar técnicas invasivas que puedan causar algún daño.

6. Ventajas e Inconvenientes de la Experimentación en Humanos

• Ventajas: Comunicación y relevancia biomédica.
• Inconvenientes: Limitación en la intervención, interferencia con el experimentador y dificultades para estandarizar.

7. Declaración de Helsinki

Objetivos:

• Mejorar diagnósticos y tratamientos.
• Ampliar el conocimiento de la enfermedad.

Principios Básicos:

• Debe estar basado en estudios con animales.
• Revisión por comités y supervisado por un médico.
• Los beneficios deben superar los riesgos para el sujeto.
• Salvaguardar la integridad e intimidad del sujeto.
• Minimizar los riesgos y suspender en caso de riesgos imprevistos.
• Publicar datos exactos.
• Consentimiento informado.
• Adoptar el método de tratamiento o diagnóstico disponible.

8. Ventajas e Inconvenientes de la Experimentación con Animales

• Ventajas: Posibilidad de más procedimientos, menos problemas éticos y regulación más laxa.
• Inconvenientes: No hay comunicación y tiene poca relevancia biomédica, ya que no se asegura que funcione en humanos.

9. Principio de las 3 R’s

• Reemplazo: Evitar usar animales conscientes, utilizando sistemas in vitro, animales muertos, invertebrados, técnicas modernas, etc.
• Reducción: Del número de animales, usando, por ejemplo, animales transgénicos, evitando repetir estudios informándose en bancos de datos, bioestadística especializada, etc.
• Refinamiento: De las técnicas para reducir el dolor y la molestia mediante el cuidado y bienestar del animal. Se necesita destreza del personal que va a realizar el experimento. Incluye el uso de anestesia, analgésicos, técnicas no invasivas (ej., radiografías) y eutanasia anticipada.

10. Finalidad del Real Decreto 2005

Este decreto busca:

• Prevención, diagnóstico y tratamiento de enfermedades.
• Desarrollo y fabricación de productos farmacéuticos y alimenticios.
• Investigación médico-legal.
• Estudios fisiológicos.
• Protección del medio ambiente y mantenimiento de la biodiversidad.
• Educación y formación.

Condiciones Generales del Real Decreto 2005:

• Centros de alojamiento con condiciones adecuadas a la especie.
• Satisfacer necesidades fisiológicas y etológicas.
• Bienestar y eliminación de deficiencias, supervisados.
• Plan de emergencia.
• Evitar acceso a personal no autorizado.
• Transporte: Documentación adecuada, contención de animales, cierta libertad.
• Identificación: Familiar.
• Tratamientos.
• Registro de animales y centros.
• Procedimientos: Existencia de otros métodos, evitar angustia y dolor, evitar duplicaciones, elección del método (menor número de animales, especie, menor sufrimiento), realización por personas competentes.
• Prohibido (salvo excepciones): Animales en peligro de extinción, capturados o vagabundos (nunca perros y gatos), educación y enseñanza no superior.
• Anestesia y analgesia: Excepto si es más traumático que el procedimiento en sí, salvo autorización si es incompatible con el procedimiento, no más de una vez por animal.
• Fin del procedimiento: En casos en que es probable el sufrimiento o dolor.
• Comités éticos: Expertos en bienestar animal, ajenos al procedimiento, informe de la idoneidad del procedimiento, velar por medios de analgesia, anestesia y eutanasia adecuados, personal con formación adecuada.

Real Decreto 2013: Novedades y Clasificación de Procedimientos

Personal Competente:

• Cuidado de los animales.
• Eutanasia de los animales.
• Realización de los procedimientos.
• Diseño de los proyectos y procedimientos.
• Responsabilidad de la supervisión in situ del bienestar y cuidados de los animales.
• Asumir las funciones de veterinario designado.

Novedades:

• Sistema de control de procedimientos con inspecciones.
• Creación del Comité Español para la Protección de Animales Utilizados con Fines Científicos y de Órganos Encargados del Bienestar Animal (OEBA).
• Clasificación de los procedimientos en cuanto a su severidad:
  • Sin recuperación: Bajo anestesia general sin recuperación de consciencia.
  • Leve: Dolor, sufrimiento o angustia leves de corta duración, así como los procedimientos sin alteración significativa del bienestar o del estado general de los animales.
  • Moderado: Dolor, sufrimiento o angustia moderados de corta duración, o leves pero duraderos, así como los procedimientos que pudieran causar una alteración moderada del bienestar o del estado general de los animales.
  • Severo: Dolor, sufrimiento o angustia intensos o moderados pero duraderos, así como los procedimientos que pudieran causar una alteración grave del bienestar o del estado general de los animales.

Preparaciones In Vivo en Fisiología Experimental

1. ¿Qué son las Preparaciones In Vivo?

Son preparaciones en las que se utiliza el animal vivo y su organismo completo. Esto no implica que no se puedan tratar cuestiones más concretas. Permiten conocer un sistema fisiológico completo. Siempre se trabaja dentro del contexto homeostático del animal, donde las condiciones (células, tejidos, sistemas) las rige el mismo. Esta es una ventaja, ya que un mínimo cambio a las condiciones naturales podría resultar en un fracaso experimental.

2. Aplicaciones de Técnicas In Vivo

Permiten estudiar el organismo completo, las relaciones entre sistemas y/u órganos, y sistemas fisiológicos completos. Siempre dentro del contexto homeostático del animal.

3. Tipos de Preparaciones In Vivo, Anestesia y Conflicto Ético

Hay tres tipos de preparaciones:

• Animal intacto: Sin anestesia.
• Preparaciones agudas: Anestesia durante todo el proceso.
• Preparaciones crónicas: Anestesia en momentos puntuales.

Las tres presentan conflictos éticos, pero en las agudas, al usar anestesia durante todo el proceso, este conflicto es menor. La anestesia es necesaria, pero puede influir en los resultados.

4. Ventajas e Inconvenientes de las Preparaciones Agudas

• Ventajas: El propio animal mantiene el estado del tejido (homeostasis mantenida por el animal), conexiones intactas, estabilidad mecánica y las variables también son estables. Al poder usar técnicas invasivas, los datos obtenidos son más específicos.
• Inconvenientes: Por la anestesia, los resultados pueden variar, requieren respiración asistida, mantenimiento de la temperatura corporal por enfriamiento y deterioro de la preparación con el tiempo.

5. Animal Intacto vs. Preparaciones Agudas

• Animal intacto: La homeostasis está intacta, la calidad es óptima y se usan técnicas no invasivas, por lo que los datos obtenidos son generales. Requiere diseños experimentales complejos.
• Preparaciones agudas: La homeostasis está alterada, la calidad es deteriorada y se usan técnicas invasivas, por lo que los datos obtenidos son específicos.

6. Preparaciones Crónicas: Telemetría

La telemetría permite el registro de variables fisiológicas de animales conscientes y con libertad de movimientos. Evita artefactos debidos al estrés y proporciona un ambiente libre de la influencia del investigador. Se utilizan sensores implantables de tamaño muy pequeño, que se pueden alojar en el organismo y que interfieren mínimamente en la fisiología y el comportamiento normales del animal estudiado.

Preparaciones In Vitro y Ex Vivo en Investigación Fisiológica

1. In Vitro vs. In Vivo

Al trabajar in vivo, el animal suele estar despierto, lo que supone un mayor conflicto ético, ya que puede sufrir durante el experimento. En las preparaciones in vitro no existe este conflicto ético, ya que se pueden extraer biopsias o líneas celulares que se mantienen en el laboratorio, pero se necesita mucha sofisticación de la técnica y conocimiento para mantener las condiciones lo más parecidas a lo que eran dentro del organismo.

Ventajas Científico-Técnicas de las Preparaciones In Vitro:

• Material homogéneo.
• Tipo de célula concreto.
• Técnica especializada.
• Reproducibilidad.

(Desventajas: Falta de interacciones, homeostasis artificial, dificultad de extrapolación).

Ventajas Experimentales de las Preparaciones In Vitro:

• Rapidez.
• Control de la concentración.
• Menos cantidad de producto.
• Control del tiempo de contacto.
• Menos residuos.

(Desventajas: Condiciones de ensayo, sustancias problemáticas, duración del estudio).

2. Procedimiento de las Preparaciones In Vitro

1. Elección del animal (normalmente jóvenes, por tener tejidos más elásticos y resistentes).
2. Anestesia (gaseosa o inyectable).
3. Disección.
4. Conocer la conformación del tejido.
5. Conservación de la muestra.

3. ¿Qué son las Preparaciones Ex Vivo?

Experimentos o medidas realizadas en o sobre tejidos biológicos de un organismo en un ambiente artificial fuera del organismo, con las alteraciones mínimas de las condiciones naturales.

4. Elementos Necesarios para la Extracción del Tejido

• Lupa.
• Luz fría.
• Material de cirugía.
• Anestesia.
• Hielo (para reducir el metabolismo del tejido).

5. ¿Cómo se Mantienen los Tejidos?

Se mantienen mediante los baños de órganos. Un recipiente donde hay un fluido en el que se introduce el tejido y donde se puede realizar el experimento. El líquido que se introduce es un líquido intersticial que simula la composición de las condiciones naturales y se compone por sales o diferentes sales con una concentración concreta, un regulador de pH para mantener la osmolaridad y una sustancia nutritiva como la glucosa.

6. ¿Cómo se Provee de Oxígeno al Tejido?

Se provee mediante el carbógeno. Contiene oxígeno y CO₂. El oxígeno se disuelve en el líquido intersticial, llegando a la muestra para la respiración celular, y el CO₂ produce un tampón bicarbonato que genera una reacción de equilibrio bidireccional que ayuda a mantener el pH.

7. Procedimiento General de los Cultivos Celulares

1. Condiciones estériles.
2. Medios de cultivos estériles y con antibióticos.
3. Elección del animal adecuado.
4. Separación del tejido de interés (disgregación mecánica o enzimática).
5. Dilución y separación de células hasta la densidad buscada.
6. Sembrado en placas o pocillos.
7. Mantenimiento de las células usando incubadores de pH, CO₂, temperatura y antibióticos.

8. Ejemplos y Aplicaciones de los Cultivos Celulares

Estudios de sinaptogénesis, para comprobar la expresión de proteínas, cómo se forman los contactos celulares, interacción de células, screening, actividad de señalización, células para trasplantes, imagen de calcio, contactos celulares, interacciones con matriz, etc.

9. ¿Qué es el Screening?

Es un proceso usado con cultivos celulares para la imagen de calcio en el que se buscan efectos de una sustancia (calcio) sobre una célula.

10. Diferencias entre Ex Vivo y Cultivos Celulares

• Ex vivo: El nivel de estudio es sistema/celular, presenta conflicto ético, los animales usados son jóvenes/adultos, la estructura es la original, presenta un mantenimiento sencillo (oxígeno, pH, iones) y la durabilidad es de 1 día.
• Cultivos celulares: El nivel de estudio es celular/molecular, menos conflicto ético que in vivo, los animales usados son prenatales/jóvenes, la estructura es artificial, presenta un mantenimiento complejo (antibióticos, hormonas, nutrientes) y la durabilidad es más amplia: semanas/días.

Modelos Computacionales en Fisiología

1. Definición de Modelo Computacional

Es la reconstrucción de una situación experimental, no sobre el animal, sino sobre datos conocidos. Se utiliza la información para desarrollar un modelo en el ordenador que permita estudiar los procesos fisiológicos como si fuera en un animal, incorporando algoritmos para calcular el valor de la variable dependiente en función de las independientes.

2. Variables del Modelo Computacional

Se toma una variable dependiente, que es la que se mide, y una variable independiente, que es la que varía para ver el efecto que tiene sobre el estudio.

3. Pasos para Construir un Modelo Computacional

1. Observar la realidad y definir el problema.
2. Definición cuantitativa (definir variables).
3. Formulación matemática.
4. Formulación de programación a partir de los algoritmos para que sea capaz de hacer los cálculos necesarios para que el modelo funcione.
5. Sistema de visualización mediante valores numéricos, gráficas, realidad virtual.

4. Ejemplos de Modelos Computacionales

• En cirugía, se puede generar una reconstrucción digital para crear con impresoras 3D la réplica de un hueso.
• Modelos de sistema nervioso.
• Modelos de corazón.
• Modelos de riñón.
• Modelos de sistema digestivo.
• Modelos de músculo.
• Modelos de canal iónico.
• Modelos de neurona.
• Modelos de red neuronal.
• Modelos de comportamiento.
• Interacciones moleculares.
• Estructura de proteínas.
• Diseño de fármacos.

5. Proyectos Blue Brain y Human Brain Project

• El proyecto Blue Brain se propuso simular el funcionamiento de una estructura de la columna vertebral de 0.5 mm de ancho y 2 mm de alto, donde se encuentran 10 mil neuronas y 1 billón de contactos sinápticos. Se necesita mucho poder computacional y mucho conocimiento.
• A raíz de este experimento, la UE se ha involucrado económicamente en proyectos como el Human Brain Project, cuyo objetivo es simular el cerebro, así como un mapa cerebral de enfermedades, y desarrollar un programa de ordenador robótico inspirado en el cerebro. Se utiliza para estudios morfológicos y electrofisiológicos.

6. Aplicaciones de los Modelos Computacionales

• Estudiar relaciones complejas entre variables.
• Hacer predicciones.
• Determinar valores de parámetros.
• Estudiar fenómenos inaccesibles.
• Modelos pedagógicos de fenómenos y procedimientos simplificados (sencillez) que consiguen evitar el uso de animales.

Usos Específicos:

• Cirugía.
• Estructura de proteínas.
• Interacciones moleculares.
• Diseño de fármacos.

y 6: Electrofisiología: Registro de la Actividad Eléctrica Celular

1. Mecanismos de Comunicación de Fluidos en la Membrana Lipídica

La membrana lipídica tiene fluidos extra e intracelular, que se mantienen comunicados por las bombas que actúan en contra del gradiente y los potenciales de membrana que actúan a favor del gradiente.

2. Canales de Na⁺/K⁺

En los canales de Na⁺/K⁺ se produce un potencial de acción. Cuando los canales de Na⁺ se abren, entran a la célula con carga positiva y dentro se produce una despolarización. Cuando se cierran, se abren los de K⁺ y salen, produciéndose una repolarización. Este flujo de iones se observa desde fuera de la célula, permitiendo estudiarla desde el exterior.

3. Equipo de Registro y Electrodos en Electrofisiología

El equipo incluye:

• Mesa antivibratoria para estabilidad mecánica.
• Estereotáxico para sujetar al animal.
• Amplificador para amplificar la señal y eliminar el ruido.
• Micromanipulador para introducir el electrodo en sitios concretos.
• Electrodos, los cuales reciben la señal eléctrica.

Los electrodos usados pueden ser capilares de vidrio que se rellenan con una solución salina o metálicos (plata, oro…).

4. Ejemplos de Técnicas Invasivas y No Invasivas

Técnicas No Invasivas:

• EEG (Electroencefalografía): Mide la actividad eléctrica cerebral.
• EMG (Electromiografía): Mide la actividad eléctrica muscular.
• ECG (Electrocardiografía): Mide la actividad eléctrica del corazón.
• EOG (Electrooculografía): Mide los movimientos oculares.

Estas técnicas son sencillas, pero no proporcionan datos detallados y utilizan electrodos cutáneos.

• Ejemplo de Electrocardiograma: Mide señales eléctricas del corazón desde fuera del cuerpo (grandes y sincrónicas). Cuando se contraen las aurículas, todas lo hacen a la vez, generando un potencial de acción que se suma. En los ventrículos, la señal es mayor al haber más células.

Técnicas Invasivas:

• Potenciales de campo.
• Registros extracelulares.
• Registros intracelulares.
• Patch-clamp.
• Voltage-clamp.

Estas técnicas son complejas, proporcionan datos precisos y utilizan electrodos insertados.

• Voltage-clamp: Dentro del registro de corrientes, es una técnica invasiva. Permite registrar las corrientes de una célula manteniendo el voltaje de una célula fijo. Mide la corriente eléctrica; el movimiento de iones fuera/dentro, al tener carga, produce esta corriente eléctrica que es la que se mide.

5. Análisis de Datos en Técnicas No Invasivas

Se puede llevar a cabo a través de:

• Cartografía cerebral: Distribución topográfica de la actividad de la corteza del encéfalo a través de un encefalograma (EEG).
• Análisis visual.

6. Posibles Aplicaciones de las Técnicas No Invasivas

• Diagnóstico clínico.
• Investigación (ej., estudio del sueño).

7. Tipos de Registros Extracelulares

En estos registros no se introduce el electrodo, por lo que se observa lo que ocurre en el exterior.

• Potenciales de campo: Se observa la actividad de varias neuronas a la vez (se mide la actividad de una zona del tejido con alta actividad neuronal). Hay dos electrodos, uno de registro y otro de referencia; la diferencia de señal entre ambos ayuda a eliminar el ruido. (Los electrodos usados pueden ser de vidrio o metálicos, con solución salina).
• Estudio de neuronas individuales: Se usa un capilar de vidrio oscilado y un electrodo de referencia (se puede rellenar con líquido extracelular). La actividad observada son potenciales aislados de una sola neurona.

8. Registros Intracelulares

Se usa el mismo electrodo para todo el experimento. El electrodo debe ser muy fino porque va dentro de la célula y debe estar relleno de una solución conductora para evitar daños. Los datos obtenidos son más detallados y las señales más notables y mayores (es más complicado).

• Ejemplo: Se detecta una diferencia de potencial que antes no era visible, y se aplica corriente positiva y negativa. La negativa hace que el potencial de la neurona sea más negativo también, y si la intensidad del estímulo es grande, se observa que se empieza a crear un potencial de acción.

9. Diferentes Configuraciones del Patch-Clamp

• Whole-cell: El electrodo está unido a la membrana, y se puede romper un trozo para acceder a todo lo que ocurre dentro de ella. La solución del electrodo es parecida a la intracelular.
• Outside-out patch: Se usa cuando solo interesa un trozo de la membrana. Se rompe la membrana y, al retraerse, esta se estira y colapsa, quedando fuera la parte externa. El líquido del electrodo será igual a la intracelular, ya que está en contacto con el interior.
• Inside-out patch: El electrodo está sellado y, al retirarlo, se lleva una parte de la membrana, colapsando esta. Al exponerla al aire, se acaba rompiendo, quedando la parte interna pegada al exterior del electrodo. Tiene lugar también en un medio con mucho calcio. El líquido del electrodo será igual a la solución extracelular. Es la menos común y se usa para estudiar el efecto de una sustancia sobre el interior celular.

10. Patch-Clamp vs. Registros Intracelulares

Similitudes:

• Mismo electrodo que registra y estimula.
• Buena relación señal-ruido.
• Invasivo (posibilidad de hacer daño).
• Requiere buena estabilidad mecánica.
• En ambos se pueden hacer marcajes intracelulares.

Diferencias:

• Mayor influencia sobre el tejido intracelular.
• Gran capacidad de aplicación de corriente.
• Electrodos de registro rellenos de solución intracelular.
• El Patch-clamp utiliza un microelectrodo de vidrio más grueso y menos resistente.

11. Comparativa de Registros Electrofisiológicos

A continuación, se presenta una tabla comparativa de los registros extracelulares, intracelulares y patch-clamp:

12. ¿Qué es un Potencial de Acción?

Un potencial de acción es un cambio rápido, transitorio y que se propaga en el potencial de membrana de una célula excitable (como una neurona o célula muscular), caracterizado por una elevación y posterior caída del voltaje a través de la membrana celular.

Métodos de Medición de Calcio y Sensores Fluorescentes

1. Métodos para Medir el Calcio

• Calcio total: Extracción de células o tejidos y realización de un marcaje radioactivo. El inconveniente es que solo se mide el calcio del citoplasma.
• Flujo de calcio: Mediante la radioactividad y el estudio de corrientes. El inconveniente es que se mide el calcio que se ha movido, pero no el que se ha quedado.
• Calcio libre en el citoplasma: Con aequorinas (de medusas) o quelantes (sustancias que se unen al Ca²⁺).

2. ¿Qué es el Fura-2?

Fura-2 es una de las moléculas más usadas para realizar un marcaje de calcio. Es capaz de unirse al calcio y emitir fluorescencia. Dependiendo del calcio libre en el medio, variará la fluorescencia; a mayor calcio, mayor capacidad de excitarse.

3. ¿Cuáles son las Formas Químicas de los Marcadores?

En forma de sales, conjugados en dextranos y acetometil ésteres.

4. Sensores Potenciométricos Rápidos y Lentos

Ambos son potenciométricos y actúan frente a cambios en el potencial a un lado y otro de la membrana.

• En el sensor potenciométrico rápido, la molécula que se introduce en la membrana tiene carga positiva y, dependiendo de la diferencia de potencial que se genere, esta molécula tendrá un color u otro; si se despolariza, se hará más negativa, volviéndose más oscura, y si se hiperpolariza, se hará más positiva, volviéndose más clara.
• En el sensor potenciométrico lento, la molécula tendrá carga negativa y su distribución dependerá de si está en el medio extracelular (oscura) o intracelular (clara). Cuando el interior se hace más negativo, tenderá a estar fuera (claro), y cuando el interior es más positivo, tenderá a estar dentro (oscuro). Observando la intensidad, se puede determinar si la molécula está dentro o fuera y una estimación de la diferencia de potencial.

5. ¿Qué es la GFP (Green Fluorescent Protein)?

Es una proteína fluorescente que permite generar múltiples herramientas, como sensores de calcio codificados genéticamente. Se realizó una construcción que contenía CFP (cian) y YFP (amarillo). Cuando no había calcio, únicamente se emitía cian, pero en el caso de que hubiese calcio, las dos proteínas CFP y YFP estaban lo suficientemente cerca como para recibir azul y emitir amarillo. En función de la intensidad de estos dos colores, se puede estimar la concentración de calcio.

Técnicas de Imagen Avanzadas en Fisiología

1. Inconvenientes del Uso de Rayos X Convencionales

• Es imposible mostrar toda la información 3D en una imagen 2D.
• Objetos situados en distintas profundidades se superponen y generan una imagen difusa.
• Los rayos X convencionales no permiten distinguir entre tejidos blandos; en general, solo diferencian entre hueso y vacío.
• Cuando se utilizan rayos X convencionales, no se pueden medir cuantitativamente las distintas densidades de las sustancias.

2. ¿Qué es la Tomografía Computarizada (TC)?

Con ella se puede ver el interior del hueso. Es una técnica anatómica y ofrece imágenes físicas. Utiliza rayos X y realiza numerosas radiografías a la vez alrededor del objeto desde diferentes orientaciones y distancias. Se puede cuantificar la densidad de un órgano según lo claro que sea. Se compone por un emisor de rayos X, un detector y un sistema informático que reconstruye la imagen.

3. ¿Qué es la PET (Tomografía por Emisión de Positrones)?

PET es la tomografía por emisión de positrones, y con ella se puede estudiar el funcionamiento de órganos y tejidos. Se necesita introducir un radiofármaco que emite positrones (+) y se desplazan por el tejido hasta chocar con un electrón, emitiendo fotones por aniquilación.

4. Ejemplos de Radiofármacos

Glucosa, agua, aminoácidos y neurotransmisores, todos ellos unidos a un átomo radioactivo.

5. Resonancia Magnética (RM) y Resonancia Magnética Funcional (RMf)

La principal diferencia es que en la resonancia magnética se obtiene una imagen física. En ella se miden los movimientos de los átomos que generan un dipolo magnético. Se suele usar el hidrógeno al presentar un único electrón. Estos átomos se someten a un campo magnético, alineándose, y la señal se mide aplicando un pulso de radiofrecuencia; los átomos se colocan en la dirección contraria, y al cesar, vuelven a su posición de origen y emiten la señal que se busca. Está compuesto por un anillo de electroimanes y bobinas de radiofrecuencia.

En la resonancia magnética funcional, se encuentra un ejemplo, BOLD (Blood-Oxygen-Level Dependent), en el que se mide la zona del tejido donde el nivel de oxigenación en sangre cambia. Cuando unas células trabajan más de lo debido, necesitan más oxígeno, llegando a ellas sangre más oxigenada; por lo que cuanta más actividad hay, más sangre oxigenada hay, o lo que es lo mismo, cuanta más actividad hay, menos desoxihemoglobina hay (sangre sin oxígeno).

Marcadores Fluorescentes (Resumen)

• Sensores fluorescentes para calcio.
• Proteínas fluorescentes (ej., GFP).
• Aplicaciones.
• Funciones del calcio intracelular.
• Métodos para medir calcio.
• Imagen de calcio: Fura-2 y derivados.
• Otros indicadores o sondas.