Principios de Espectrofotometría y Cuantificación de Proteínas
Espectrofotometría de absorción
La espectrofotometría de absorción es una técnica que mide, en un rango de 220 a 800 nm, la atenuación que una muestra efectúa sobre una radiación incidente sobre sí misma con un espectro definido. Este espectro incluye:
- Radiación visible: por encima de 380 nm.
- Radiación ultravioleta (UV): por debajo de 380 nm.
- Región infrarroja: por encima de 800 nm.
La energía de la radiación UV y visible excita los electrones pi (π) y no enlazantes (presentes en moléculas conjugadas) desde su estado basal a un nivel energético mayor. Como resultado, la molécula absorbe luz a la longitud de onda correspondiente. La conjugación en una molécula aumenta la longitud de onda de la absorción al disminuir la diferencia energética entre el estado basal y el excitado.
Cromóforo
Un cromóforo es la estructura de enlaces conjugados que permite la absorción de luz. La absorción de luz por una sustancia se utiliza como propiedad para su identificación y cuantificación.
Variables que afectan el grado de absorción
Existen dos variables principales que afectan el grado de absorción de la luz:
- La concentración del absorbente en la solución.
- La longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a través de la solución.
Ley de Lambert-Beer
La Ley de Lambert-Beer establece que la absorción es directamente proporcional al número de moléculas de la sustancia absorbente presentes en la solución por donde pasa el haz electromagnético.
Espectrofotómetro
Un espectrofotómetro es el instrumento utilizado para medir la absorbancia. Sus componentes principales son:
- Fuente luminosa: emite luz en un amplio rango de longitudes de onda.
- Selector de longitud de onda (monocromador): permite el paso de la luz a una longitud de onda específica.
- Cubeta: recipiente que contiene la muestra, generalmente de 1 cm de diámetro, que no interfiere con el paso de la luz. Posee una rendija que define la intensidad de la luz incidente.
- Detector y sistema fotométrico: cuantifica la luz que atraviesa la muestra y proporciona una lectura de absorbancia (relacionada de forma lineal con la concentración) o de porcentaje de transmitancia.
Absorbancia de una solución y uso del blanco
La absorbancia medida en una solución es el resultado de la suma de la absorbancia del soluto de interés y la de otros componentes del sistema que también absorben a la misma longitud de onda. Estos componentes producen interferencia y deben ser descartados mediante el uso de un blanco, que es una solución que contiene todos los componentes de la muestra excepto el que se desea medir.
Curva de calibración
La curva de calibración es necesaria en trabajos cuantitativos donde se debe calcular la concentración del absorbente. Se realiza en la primera fase del experimento y sirve para estandarizar cualquier procedimiento fotométrico.
Proteínas
Las proteínas son biomoléculas de gran importancia formadas por secuencias de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos (un tipo de enlace amida). Son poliamidas de alto peso molecular provistas de una estructura tridimensional compleja, organizada en varios niveles:
- Estructura primaria: la secuencia de unión de los aminoácidos.
- Estructura secundaria: el primer grado de plegamiento de la cadena polipeptídica (ej. hélice alfa, lámina beta).
- Estructura terciaria: el segundo grado de plegamiento, que le otorga a la proteína su forma tridimensional y superficie exterior características.
Las propiedades biológicas de una proteína dependen de la integridad de estas estructuras. Cualquier alteración provoca que la proteína pierda sus propiedades físicas, químicas y funcionales, un proceso conocido como desnaturalización (pérdida parcial o total de la estructura terciaria).
Electroforesis
La electroforesis es una técnica que permite el estudio de la movilidad de las proteínas en un gel, lo que facilita su separación y caracterización previa cuantificación.
Métodos de cuantificación de proteínas
Método de Biuret
En presencia de dos o más enlaces peptídicos, las proteínas pueden reaccionar con sulfato de cobre en un medio alcalino, formando un complejo de color púrpura. El color es causado por el complejo de coordinación formado entre el átomo de cobre y cuatro átomos de nitrógeno. La cantidad de producto formado, y por tanto la intensidad del color, es proporcional a la concentración de proteína. Para su cuantificación, se requiere una curva de calibración con una solución estándar de proteína, midiendo la absorbancia a 540 nm.
Método de Bradford
Este método se basa en la unión del cromógeno Coomassie Brilliant Blue G-250 a una solución ácida de proteína. Esta unión causa un cambio en la longitud de onda de máxima absorción del colorante, desde 465 nm a 595 nm. El aumento de la absorbancia a 595 nm está directamente relacionado de forma lineal con la concentración de proteína. Se requiere una curva de calibración con una proteína estándar (como la BSA). Tras la adición del cromógeno a la muestra, el desarrollo del color azulado es completo en 2 minutos y permanece estable por más de una hora.
Introducción a la Cinética Enzimática
Enzimas
Las enzimas son catalizadores biológicos utilizados para que las reacciones químicas transcurran a velocidades útiles para la célula. En una reacción catalizada por una enzima, esta actúa agregando pasos intermedios a la reacción para que la energía de activación sea menor.
Equilibrio químico
El equilibrio químico es el estado en el que tanto la reacción directa como la inversa ocurren a la misma velocidad. Un catalizador aumenta la velocidad a la que la reacción se acerca al equilibrio, pero no altera la naturaleza del estado de equilibrio. Los catalizadores son efectivos en cantidades muy pequeñas.
Cinética enzimática
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Las moléculas en una solución se mueven a una velocidad particular cada una. Este movimiento implica colisiones, y estas involucran una cierta cantidad de energía. Si la energía de la colisión no es suficiente, la reacción no ocurre. Si la energía es suficiente, las moléculas se combinan para formar un intermediario activado, estableciendo un estado de transición.
Energía de activación
La energía de activación es la energía mínima que se requiere para formar el intermediario activado y que la reacción proceda.
Cambio de energía libre (ΔG)
El cambio de energía libre es la diferencia de energía que se produce entre el estado inicial (sustrato) y el producto final. Con o sin enzima, los niveles de energía libre inicial y final son los mismos, y por lo tanto, el ΔG es el mismo. La termodinámica de la reacción no cambia.
Actividad enzimática
La actividad enzimática se mide como la cantidad de producto formado (o de sustrato consumido) por unidad de tiempo.
Unidad de enzima
Según la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica, una unidad de enzima (U) es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 micromol de sustrato por minuto bajo condiciones ideales de temperatura y pH.
Evolución de una curva de ensayo enzimático
En un ensayo, la enzima transforma el sustrato en producto, siguiendo inicialmente un comportamiento lineal que luego se manifiesta en forma de una curva asíntota a medida que el sustrato se agota. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el período inicial lineal puede durar desde milisegundos hasta horas.
Métodos de análisis y controles experimentales
Para detectar y determinar la actividad de una proteína enzimática, se necesita conocer el sustrato y el producto, además de disponer de métodos analíticos para medirlos. Es crucial considerar los controles experimentales para descartar que el producto aparezca o el sustrato desaparezca por otras razones.
Blanco de sustrato
Es una mezcla de reacción semejante a la que detecta la actividad enzimática, pero en ella se reemplaza la solución que contiene al sustrato por un volumen equivalente de su solvente (agua o buffer). Sirve para medir cualquier cambio no debido a la transformación del sustrato.
Blanco de enzima
Similar al anterior, pero se reemplaza la solución que contiene a la enzima. Este blanco es importante cuando el sustrato es inestable y se puede obtener producto en ausencia de la enzima (degradación espontánea).
Tiempo cero
Este control contiene todos los componentes necesarios para la detección de la actividad enzimática, pero la reacción es detenida en el momento mismo en que se inicia (generalmente con la adición de la enzima o del sustrato). Mide la señal de fondo al inicio de la reacción.
El método analítico más común para determinar la cantidad de producto formado es el espectrofotómetro.