Fundamentos del Cultivo de Bacterias
El cultivo de bacterias es el proceso de fomentar la multiplicación de microorganismos en un medio nutritivo controlado para identificarlos y estudiarlos. Este procedimiento se utiliza para diagnosticar infecciones y determinar la susceptibilidad a antibióticos. Para identificarlos, es necesario realizar pruebas bioquímicas que permitan conocer su metabolismo y las características específicas de la bacteria: si produce gas, si es capaz de utilizar el manitol o diversos azúcares, y si produce enzimas para degradar la lactosa. También se observa si la colonia es cóncava o brillante. Con las pruebas bioquímicas, realizamos principalmente la identificación del metabolismo (si es fermentador, oxidativo, inerte, etc.).
Esquema Básico del Diagnóstico Bacteriológico
A partir de una muestra clínica, se sigue el siguiente flujo de trabajo:
- Cultivo Primario o siembra inicial:
- Técnica de siembra por agotamiento.
- Obtención de cultivos mixtos y colonias.
- Estudio de características morfológicas y culturales (colonias obtenidas).
- Características morfológicas y tintoriales.
- Cultivo Secundario: (Obtención de cultivos puros y colonias aisladas)
- Técnica de siembra por agotamiento.
- Estudio de las características morfológicas y culturales de las colonias.
- Características morfológicas y tintoriales de las bacterias obtenidas.
Procesamiento de la Muestra Clínica
Lo primero que se requiere es la muestra clínica. En el laboratorio, la etapa inicial se denomina cultivo primario o siembra inicial, donde se suelen utilizar medios como el agar sangre. Generalmente, este será un cultivo mixto, ya que estarán presentes diversas bacterias Gram positivas y Gram negativas. No obstante, es posible obtener un cultivo puro si solo hay una especie presente. Por ejemplo, en tejidos estériles como el líquido cefalorraquídeo (ante una sospecha de meningitis), solo debería encontrarse un género bacteriano. Las muestras de tejidos estériles pueden resultar puras o no presentar crecimiento.
Es fundamental trabajar con cultivos puros y aislados para poder montar las pruebas bioquímicas. En el cultivo secundario, se realiza un repique del cultivo primario hacia otra placa, dependiendo de las características observadas. Se debe realizar una tinción de Gram y aislar las colonias. Es necesario evaluar las características morfológicas y culturales: si son grandes, blancas, color crema, amarillas, convexas, cóncavas o planas; si tienen bordes lisos o si presentan hemólisis (si «se comió la sangre»). Asimismo, se determinan las características tintoriales mediante la coloración de Gram para diferenciar entre bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Metodología de Siembra y Definiciones
Una vez identificadas las bacterias, se procede a la identificación bioquímica seleccionando el tipo de prueba, ejecutándola y analizando los resultados.
- ¿Qué es la siembra?: Es la acción o mecanismo por el cual se colocan bacterias en un medio de cultivo para favorecer su crecimiento.
- Cultivo: Es la obtención del crecimiento bacteriano tras proporcionar todos los requerimientos necesarios. Pueden ser mixtos o puros.
- Finalidades: Mantener viable al microorganismo y aislarlo para su posterior identificación.
- Cultivo mixto: Aquel donde se obtiene más de un género bacteriano.
- Cultivo puro: Aquel en el que se obtiene solo una bacteria (común en tejidos estériles). Presenta un crecimiento confluente.
- Inóculo: Es la porción de la muestra que se siembra.
Técnicas de Siembra según el Medio
Siembra en medios de cultivo líquidos
Se utilizan medios como el caldo BHI (Infusión Cerebro Corazón), agua peptonada o caldo nutritivo. Los métodos incluyen:
- Método con pipeta: De medios líquidos a medios líquidos.
- Método con asa bacteriológica: De medios líquidos o sólidos a líquidos.
Siembra en medios semisólidos
Se utilizan medios como gelatina o medio SIM, empleando la técnica de punción.
Siembra en medios sólidos
Se utilizan medios como el citrato de Simmons o agar nutritivo inclinado.
- Estría continua (Agar inclinado en tubo): Se toma la muestra y se siembra en forma de zigzag (sicsac). Es muy utilizado en el análisis de alimentos. Nota: Todo el procedimiento debe realizarse cerca del mechero.
- Estría continua para leche: Se siembran 4 muestras en una sola placa (correspondientes a los 4 cuartos mamarios) para identificar cuál presenta la lesión.
- Técnica de siembra por agotamiento: Su finalidad es agotar el número de bacterias de la muestra para obtener colonias aisladas. La placa se divide en cuatro cuadrantes en el sentido de las agujas del reloj. El cuarto cuadrante debe ocupar entre el 40% y 60% de la placa, ya que allí se encontrarán las colonias aisladas para trabajar.
Nota sobre el uso del asa: Dependiendo de la muestra, se debe esterilizar el asa entre cuadrantes. En muestras clínicas generales no se esteriliza entre cuadrantes, pero en muestras muy contaminadas (como las heces) se hace la excepción. La técnica por agotamiento se realiza solo en medios sólidos en placas.
Pruebas Bioquímicas de Identificación
Estas pruebas determinan el metabolismo bacteriano mediante procedimientos de laboratorio. Se dividen en primarias y secundarias.
Pruebas Primarias
Permiten identificar incluso géneros bacterianos. Es fundamental conocer sus fundamentos, como evidenciar la producción de acetonía, acidez en el medio o el metabolismo (fermentador u oxidativo mediante la prueba de OF).
- Prueba de la catalasa: Comprueba la presencia de la enzima catalasa, que desdobla el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. La reacción positiva libera burbujas de oxígeno.
- Prueba de la oxidasa: Detecta la enzima citocromo oxidasa. Una reacción positiva muestra una coloración rosa o roja que se oscurece a negro. Requiere cambios de pH para la reacción.
- Acción sobre los hidratos de carbono: Determina si la bacteria usa hidratos de carbono como fuente de energía por fermentación u oxidación. Se usan dos tubos con base de azúcar (glucosa): uno en condiciones de aerobiosis y otro en anaerobiosis (sellado con parafina o glicerina).
Resultados de la acción sobre carbohidratos:
- Inerte: No hay cambio (color azul de bromotimol).
- Positiva: Color amarillo (presencia de acidez).
- Oxidador: Utiliza glucosa solo en presencia de oxígeno.
- Fermentador: Utiliza glucosa en presencia o ausencia de oxígeno.
- Utilización de Citratos: Evidencia si la bacteria usa citrato de sodio como única fuente de carbono mediante la enzima citratasa. Una reacción positiva cambia el color de verde botella a azul; la negativa permanece verde.
Pruebas Secundarias
- Prueba de la Ureasa: Determina si la bacteria produce la enzima ureasa, desdoblando la urea en dos moléculas de amoníaco. Esta actividad es común en bacterias que causan cistitis y pielonefritis.
- Reacción positiva: El color cambia de rosa pálido a fucsia.
- Reacción negativa: El medio permanece en su color original (rosa pálido).